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基于组学和网络药理学的养心氏片抗心衰作用机理研究

高越  
【摘要】:中药复方制剂在临床中应用广泛,治疗效果显著,在防病治病方面发挥着重要作用。但是,大多数中药复方的作用机制与本质特征尚不明确,极大地阻碍着中药复方制剂在临床上的推广和应用。因此,只有明确中药复方的有效成分、作用靶点和相关机制,有针对性地建立合理的质量控制标准以保证临床用药的安全性和有效性,才能突破中药现代化发展所面临的瓶颈。养心氏片由人参、黄芪、丹参、党参、当归、山楂、延胡索、葛根、淫羊藿、地黄、灵芝、黄连和甘草13味药材组成,临床用于慢性心力衰竭、气虚血瘀型冠心病心绞痛、高血糖等病症,其临床疗效显著。但是,目前对养心氏片的研究仅仅停留在临床整体药效水平,其化学物质基础和保护心血管的作用机理尚不明确,其在体内“多成分-多靶点-多途径”的整体药理作用特征也没有得到深入的挖掘,极大地阻碍了在临床上的推广和应用。因此,本研究针对上述问题,运用化学物质组学、整体药效学、系统生物学和网络药理学的整体研究思路,从多层次、多角度入手,系统阐述养心氏片抗心衰的作用机理。首先,建立养心氏片化学成分库,利用UHPLC-Q-TOF/MS技术分析鉴别养心氏片化学成分以及入血成分。其次,通过构建慢性心力衰竭大鼠模型,在评价养心氏片抗心衰作用的基础上,采用代谢组学、蛋白质组学技术,对给与养心氏片后大鼠心脏组织中的内源性代谢物和蛋白进行鉴别分析,筛选相关的差异代谢标志物和差异蛋白,阐明养心氏片抗心衰作用的关键靶点和通路。最后,采用网络药理学技术构建养心氏片抗心衰作用的“成分-靶点”相互作用网络,初步阐明养心氏片抗心衰的分子机制。本文的研究内容可分为以下四个部分:一、养心氏片化学物质基础研究:首先,根据养心氏片处方中药材的有关化学成分的研究文献,采用Agilent的“formula-database-generator”工具,建立了养心氏片1500种化学成分的数据库。采用UHPLC-Q-TOF/MS技术对收集的34个标准品和养心氏片药材提取液中的化学成分进行分析鉴别,共鉴别到养心氏片中179个化学成分,主要包括皂苷类、酚酸类、生物碱类、黄酮类和萜类5类成分。进一步利用上述方法对给药血浆和空白血浆的养心氏片入血成分进行对比分析,在血浆样品中共检测得到73种原型化合物,鉴别出人参皂苷Rh1等5个化学成分的代谢物,并将成分的药材归属进行了分析,基本明确了养心氏片主要的吸收入血成分及代谢产物。二、养心氏片抗心衰药效学评价研究:本研究首先构建慢性缺血性心力衰竭大鼠模型。连续给药4周后,各组大鼠经超声心动图检测,模型组较假手术组射血分数下降69.60%,各给药组射血分数较模型组均有不同程度提高。病理切片观察大鼠心肌组织的病变程度,发现模型组大鼠心肌组织出现明显的坏死灶,高剂量养心氏片组和阳性药组大鼠的心肌坏死病变显著改善。通过检测大鼠血清中的血管紧张素转移酶活性(ACE)和醛固醇(ACD)的含量发现,模型组大鼠心肌组织中ACE活性显著增强,ACD的含量显著提高,养心氏片高剂量组的ACD浓度显著降低(p0.01),ACE的活性降低(p0.05),表明养心氏片能显著改善大鼠心衰症状。三、基于组学技术的养心氏片抗心衰分子机制研究:采用色谱质谱联用技术的整体代谢组学和蛋白组学分析方法,通过UPLC-Q-TOF/MS结合主成分分析的方法发现慢性缺血性心力衰竭大鼠心脏组织中的25个差异代谢物,这些差异代谢物主要涉及三羧酸循环,氨基酸代谢,脂肪酸代谢,能量代谢,炎症免疫等。数据分析结果显示,养心氏片在代谢层面主要通过调节能量代谢和炎症免疫反应保护心肌,从而起到抗心衰的作用。通过i TRAQ技术,分析大鼠慢性心衰模型中,养心氏片所诱导的心肌蛋白表达情况的变化。模型组与对照组鉴定得到80个差异蛋白,其中42个表达上调(p0.05),38个表达下调(p0.05);给药组与模型组鉴定得到67个差异蛋白,其中44个表达上调(p0.05),23个表达下调(p0.05)。相关靶标蛋白权重的分析结果提示,肌球蛋白轻链1、骨形态生成蛋白10、蛋白酪氨酸磷酸酶1、对氧磷酶1等蛋白可能是养心氏片治疗心衰的潜在靶点。这些蛋白标志物主要涉及能量代谢、离子交换、细胞生长和免疫调节等相关通路,与代谢组研究结果具有较强的相关性。四、基于网络药理学技术的养心氏片抗心衰“成分-靶标”相互作用网络研究:首先建立养心氏片的化合物数据库,包含明确鉴定的179个化学成分。根据养心氏片配伍理论和主要指标性成分的含量高低,从中筛选了24个成分作为代表性成分进行后续靶点对接研究。其次,结合文献报道和组学实验获得的心血管系统疾病相关蛋白靶点共1082个,构建抗心衰作用靶标数据库。然后采用Discovery Studio 3.0软件将筛选的24个养心氏片化学成分与蛋白靶标库进行对接。结果提示,养心氏片24个代表性化学成分主要作用于Toll样受体4、过氧化物酶体增生激活受体γ、血管紧张素转化酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、β1肾上腺素受体等靶点。最后综合组学和网络药理学数据,采用可视化软件Cytoscape构建养心氏片抗心衰的“成分-靶标”相互作用网络,从分子水平揭示了养心氏片主要通过提供能量,增强免疫和调节心血管功能两个方面综合发挥抗心衰作用的科学内涵。综上所述,本研究在明确了养心氏片的化学物质与药效作用的基础上,针对慢性缺血性心力衰竭模型评价养心氏片的抗心衰作用,采用代谢组学和蛋白组学技术对养心氏片抗心衰作用机制进行了整体评价,并采用网络药理学技术,对养心氏片化合物库进行高通量虚拟对接,寻找抗心衰作用靶点,构建“成分-靶标”相互作用网络。结果表明,在鉴定得到的养心氏片179个化学成分中,发现73个入血成分和5个代谢产物。从心衰大鼠心脏组织中分别发现25个代谢标志物和67个蛋白标志物与养心氏片抗大鼠心衰作用相关,主要涉及能量代谢、免疫反应、离子交换和细胞生长发育等相关通路。网络药理学研究结果提示,养心氏片的主要靶标为Toll样受体4、过氧化物酶体增生激活受体γ、血管紧张素转移酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、β1肾上腺素受体等,“成分-靶点”相互作用明确显示养心氏片主要通过促进心肌细胞活力,调节能量代谢和炎症反应发挥抗心衰的治疗作用。本研究在明确了养心氏片全方的化学物质和抗心衰药效的基础上,采用多组学和网络药理学技术联合的手段,评价了养心氏片对机体生物学网络的影响,并整体阐释了关键活性成分与蛋白靶标之间的相互作用关系。进一步通过构建“成分-靶点”相互作用网络,发现养心氏片通过影响能量代谢,调节炎症和心血管功能两条主要途径发挥治疗慢性心衰的作用。本研究为养心氏片的精确化质量控制、药效机制以及二次开发等深入研究奠定基础,同时也为中药复方的作用机制研究提供了新的研究思路和方法。


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