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苦参碱衍生物WM130抗肝细胞癌的作用及其机制研究

倪晨旭  
【摘要】:【研究背景及目的】肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)位列全球癌症死亡的第三位。肝癌晚期患者主要采用放射治疗和化学药物治疗,然而这些方法只能在治疗初期给患者带来良好的效用,随之而来的是毒性、耐药反应,复发和转移等不良反应。为了降低HCC的死亡率并提高患者治疗后的生活质量,人们已经做了许多的努力,但是到目前为止依然没有找到令人满意的治疗方法。越来越多的证据表明,肿瘤中存在的一小部分细胞称之为肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC),这些CSC是肿瘤形成、生长、复发、转移和耐药的根源,也是新型肿瘤治疗的靶细胞。研究表明,HCC中的肝癌干细胞可以通过干细胞表面标志物(如Ep CAM、CD133、CD90和CD44)来分离和鉴定;在体外可形成球体悬浮生长,类似于干细胞也有自我更新和分化的能力,并且对放射治疗和化疗药物耐受;体内CSC具有高致瘤性,接种很少的细胞就能形成肝癌。CSCs自我更新和分化,受到Wnt/β-catenin、Hedgehog和Notch等多条细胞内信号通路的调控。Wnt/β-catenin信号通路在肝脏代谢和肝再生过程中发挥着重要的作用,而Wnt/β-catenin信号通路的异常会促使肿瘤发生、肿瘤侵袭和治疗耐受等。已经有研究发现CSC标志物的抗体或利用RNA干扰技术敲减CSC标志物,能单独或者联合化疗药物抑制动物体内肿瘤的形成、生长和转移。此外,一些能抑制CSC的小分子也有类似的作用。苦参碱(matrine)是从中药苦参中提取出来的一种主要的生物碱,具有抗肿瘤、抗纤维化、抗炎和抗病毒等药理学活性。苦参碱的缺点在于效能太低并且半衰期短,为此,我们课题组以槐果碱为起始化合物,通过硫代把苦参碱结构中的羰基氧替换为硫原子,并在双键位置通过侧链加成引入了氨基团,半合成了一系列硫代苦参碱衍生物。经药理活性筛选发现,这些衍生物的抗炎、抗纤维化和抗肿瘤活性比苦参碱或槐果碱强约100倍。后续作用机制研究表明,苦参碱衍生物能抑制肝癌细胞、肝星状细胞、巨噬细胞和树突状细胞等炎症细胞AKT/GSK3β、MAPK和NFκB等信号通路,更有趣的是,我们发现苦参碱及其衍生物还能结合核糖体蛋白S5(ribosomal protein S5,RPS5),并介导其抗肝纤维化作用。新近,我们又发现它们还能特异性结合细胞膜上核糖体蛋白家族中的另一成员层粘连蛋白(laminin)受体(67KD laminin receptor,67LR)。67LR由核糖体蛋白SA(RPSA)编码,最初发现为层粘连蛋白的结合蛋白,具有促进细胞粘附、迁移、归巢、增殖、分化和极化等许多重要的生物学功能,与肿瘤转移、神经退行性疾病和发育异常等有着紧密的联系。研究发现67LR在多种肿瘤组织中高表达。绿茶提取物表没食子酸盐(epigallocatechin gallate,EGCG)是目前发现的唯一的67LR配体,可能是67LR的激动剂或变构剂,但专特性不强,细胞内靶点众多,具有广泛的药理学活性。研究表明,67LR抗体可阻断EGCG的抗肿瘤作用,说明EGCG作用于细胞膜上67LR,但是,EGCG作用于67LR的下游信号转导通路目前仍不清楚。有研究发现EGCG与67LR受体结合后,促进肿瘤细胞内蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)活性或激活Akt通路促使e NOS磷酸化和NO释放,升高细胞内cGMP。WM130是新型苦参碱衍生物中药理活性较强、毒性较低的一个衍生物,本课题我们选择苦参碱衍生物WM130研究其抗HCC的作用及其机制。迄今为止,苦参碱衍生物对肝癌干细胞的作用以及其抗肝癌作用与67LR的关系国内外均未见报道。我们证实了苦参碱衍生物WM130能在体外抑制肝癌细胞增殖和克隆形成,并且在体内抑制HCC生长。WM130还能优先抑制肝癌细胞系和成瘤模型组织中肝癌干细胞样细胞,其作用机制主要由Wnt/β-catenin信号通路介导。WM130部分通过67LR达到抗HCC的作用。【实验方法】一、苦参碱衍生物WM130对肝癌细胞增殖和克隆形成的作用研究1、肝癌细胞MHCC-LM3、Hep3B和MHCC-97H以3×103个细胞/孔接种于96孔板中,24小时后加入不同浓度WM130处理72小时,CCK8法检测细胞增殖情况,并计算半抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC50)。2、MHCC-LM3、Hep3B和MHCC-97H以1×103个细胞/孔接种于6孔板中,24小时后加入不同浓度的WM130处理17-21天(每3-5天更换新的培养基),平板克隆实验检测细胞克隆形成能力,拍照并统计克隆数(聚集大于50个细胞的细胞群算作一个克隆)。二、苦参碱衍生物WM130对肝癌干细胞样细胞的作用研究(一)WM130对多柔比星耐药的肝癌细胞的作用Hep3B和MHCC-LM3用2μmol/L多柔比星(Doxorubicin,DOX)预处理(以下表示为Hep3B-DOXR和LM3-DOXR细胞)5天后,加入WM130(0、2、10、20μmol/L)或DOX(2μmol/L)培养72小时,CCK8法检测细胞增殖情况。流式细胞术检测肝癌干细胞标志物Ep CAM阳性的细胞数目。(二)WM130对肝癌干细胞和肝细胞功能相关基因表达的影响WM130(0、2、10、20μmol/L)与Hep3B和MHCC-LM3孵育24小时后,实时定量PCR(RT-PCR)检测肝癌干细胞相关基因Ep CAM、CD133、CD90、Oct3/4、Sox2和NANOG以及正常肝细胞功能相关基因CYP1A3、G-6-P、ALB和ALDOB的表达水平。(三)WM130对肝癌细胞成球能力的影响1、选用无血清悬浮成球培养的方法富集肝癌细胞中的球体细胞(肝癌干细胞样细胞)。收集MHCC-LM3、Hep3B和MHCC-97H球体细胞,室温下用0.25%胰酶消化细胞3分钟,含10%FBS的DMEM培养基终止消化,收集细胞悬液(第一代球体细胞),供以下实验使用。球体细胞加入抗体,避光混匀后,流式细胞仪检测表达肝癌干细胞标志物Ep CAM和CD133的细胞数目。2、第一代球体细胞以1×103个细胞/孔接种于96孔低吸附板中,加入WM130(0-20μmol/L)培养7天,倒置显微镜下计数球体细胞(直径30μm)的数量,并拍摄照片观察球体的大小;第一代球体细胞用胰酶消化为单细胞悬液后,以1×103个细胞/孔接种于96孔低吸附板中,不加WM130处理使其继续生长7天,连续培养两代,统计第二、三代球体细胞的数量。3、Hep3B球体细胞用10μmol/L WM130处理4天后,再用无药培养基培养4天,然后用胰酶消化为单个细胞后,皮下注射裸鼠,1×105个细胞/只。为了避免个体差异,空白对照球体细胞以同样数量皮下注射同一只裸鼠的另一侧,测量肿瘤生长大小至45天,免疫组化(immunohistochemical,IHC)检测瘤块中Ep CAM的表达水平。三、苦参碱衍生物WM130对肝癌球体细胞的优先作用用WM130(0、2、10、20μmol/L)或DOX(0、1、2、5μmol/L)分别处理肝癌细胞和球体细胞后,检测细胞增殖情况和克隆形成能力,比较药物对两种细胞作用的差别;肝癌细胞和球体细胞用10μmol/L WM130处理后,RT-PCR检测肝癌干细胞相关基因Ep CAM、CD133和Oct3/4表达水平。四、苦参碱衍生物WM130体内对肝细胞癌生长的作用研究(一)WM130对肝癌细胞异种移植瘤生长的影响裸鼠皮下接种MHCC-LM3(1×106个细胞/只),然后随机将裸鼠分为4组:对照组(给予生理盐水)、WM130组(20mg/kg,每天灌胃)、多柔比星组(6mg/kg,每周腹腔注射一次)和WM130+DOX联合用药组。每2-3天使用电子游标卡尺测量肿瘤体积,并观察每组裸鼠体重的变化,三周后处死裸鼠,取出瘤块组织并称重。(二)WM130体内对肝癌干细胞样细胞的作用肿瘤组织一部分剪碎,使用胰酶消化为单个细胞后继续培养,用于之后的成球实验、平板克隆和单药耐药实验,剩余的组织用于IHC、RT-PCR和蛋白免疫印迹(western blot)实验。五、苦参碱衍生物WM130对Wnt/β-catenin信号通路的作用研究(一)WM130体外对Wnt/β-catenin信号通路的作用Hep3B和MHCC-LM3用WM130(0、2、10、20μmol/L)处理4天后,western blot方法检测相关蛋白β-catenin、cyclin D1、GSK3β和p-GSK3β(ser9)的表达水平。(二)WM130体内对Wnt/β-catenin信号通路的作用IHC和western blot方法检测MHCC-LM3异种移植瘤块中相关蛋白β-catenin、Ep CAM、GSK3β和p-GSK3β(ser9)的表达水平。六、苦参碱衍生物WM130抗肝细胞癌作用与67LR的关系研究(一)抗体封闭67LR表达水平对WM130抑制肝癌细胞增殖的影响Hep3B和MHCC-LM3用20mg/m L 67LR(MLu C5)抗体及其同型对照Ig M(20mg/m L)抗体在37℃5%CO2孵箱中封闭1小时后,回收抗体,再加入EGCG(40μmol/L)或WM130(0、10、20、40μmol/L)处理72小时,CCK8法检测细胞增殖情况。(二)敲减67LR表达水平对WM130抑制肝癌细胞增殖的影响67LR小干扰RNA(67LR si RNA)转染Hep3B和MHCC-LM3 48小时后,或用sh67LR慢病毒构建稳转肝癌细胞系后,加入WM130(0、10、20、40μmol/L)处理72小时,CCK8法检测细胞增殖情况。(三)EGCG对WM130抑制肝癌细胞增殖的影响EGCG(20μmol/L)和WM130(0、10、20、40μmol/L)共同处理MHCC-LM3和Hep3B 72小时,CCK8法检测细胞增殖情况。(四)磷酸二酯酶5抑制剂对WM130抑制肝癌细胞增殖的影响磷酸二酯酶5(PDE5)抑制剂西地那非(Sildenafil,20μmol/L)和EGCG(20μmol/L)或WM130(0、10、20、40μmol/L)共同处理MHCC-LM3 72小时,CCK8法检测细胞增殖情况。(五)蛋白磷酸酶2A抑制剂对WM130抑制肝癌细胞增殖的影响1、蛋白磷酸酶2A(PP2A)抑制剂冈田软海绵酸(okadaic acid,OA)(0、5、10、20、40、100n M)处理Hep3B和MHCC-LM3 3小时后,再加入20μmol/L WM130和40μmol/L EGCG继续培养72小时,CCK8法检测细胞增殖情况。2、Hep3B和MHCC-LM3用10n M OA预处理3小时后,再加入WM130(0、10、20、40μmol/L)或EGCG(0、10、20、40μmol/L)继续培养72小时,CCK8法检测细胞增殖情况。【实验结果】一、苦参碱衍生物WM130抑制肝癌细胞增殖和克隆形成CCK8结果显示WM130(0、2、10、20μmol/L)能浓度依赖性地抑制肝癌细胞Hep3B、MHCC-LM3和MHCC-97H增殖,IC50值分别是8.2、10.6和12.5μmol/L。WM130还能时间依赖性地抑制肝癌细胞增殖(0、24、48、72、96h)。平板克隆实验结果显示,Hep3B、MHCC-LM3和MHCC-97H经WM130(0、2、10、20μmol/L)长时间(17-21天)处理后,克隆数显著减少。二、苦参碱衍生物WM130对肝癌干细胞样细胞的抑制作用(一)WM130对多柔比星耐药的肝癌细胞的影响单药耐药实验显示DOX对Hep3B-DOXR和LM3-DOXR细胞增殖无抑制作用,而WM130依然能浓度依赖性地抑制Hep3B-DOXR和LM3-DOXR细胞增殖。流式细胞术的结果发现,Hep3B-DOXR和LM3-DOXR细胞中Ep CAM阳性细胞数与对照细胞(未加DOX预处理)相比分别增加约9倍和20倍。10μmol/L WM130可明显减少耐药的肝癌细胞Ep CAM阳性的细胞数。(二)WM130对肝癌干细胞和肝细胞功能相关基因表达的影响RT-PCR结果显示,WM130能浓度依赖地降低Hep3B、MHCC-LM3和MHCC-97H中肝癌干细胞相关基因(Ep CAM、CD133、CD90)、人胚胎和全能干细胞相关基因(Oct3/4、Sox2、NANOG)以及肝恶性基因(AFP)的表达水平,而增加正常肝细胞功能相关基因(CYP1A3、G-6-P、ALB、ALDOB)的表达水平,其中胆绿素合成酶(BR)的表达水平没有发生明显变化。提示WM130能促进肝癌干细胞向肝细胞分化。(三)WM130对肝癌细胞成球能力的影响流式细胞术的结果显示,Hep3B和MHCC-97H球体细胞含有Ep CAM和CD133双阳性的细胞数高达95%以上,MHCC-LM3球体细胞含有Ep CAM和CD133阳性的细胞数分别为65%和43%。WM130能浓度依赖性地减少三种球体细胞中Ep CAM阳性细胞数,但对CD133阳性细胞无影响。WM130还能显著减少第一代球体细胞的数量并减小其体积;将第一代球体细胞在没有WM130处理的情况下连续培养两代,第二、三代球体细胞的数量依然减少,表明WM130能抑制CSC的自我更新能力。我们还比较了WM130处理的Hep3B球体细胞和无药处理的对照细胞在体内的成瘤能力。无药处理的对照细胞在裸鼠皮下接种2-3周后,就长出了可触及的肿瘤(直径大约1毫米),而WM130处理组细胞直到4-5周,皮下才长出肿瘤;接种45天后取出肿瘤,发现WM130处理组的肿瘤大小明显小于对照组的肿瘤。IHC结果表明,与对照组相比,WM130处理组肿瘤组织中Ep CAM的表达水平减少大约35%(P0.01)。三、苦参碱衍生物WM130优先抑制肝癌球体细胞CCK8结果发现,WM130(2、10、20μmol/L)对Hep3B、MHCC-LM3和MHCC-97H三种球体细胞增殖抑制作用强于对三种肝癌细胞的作用。与之相反的是,化疗药物DOX(1、2、5μmol/L)对肝癌细胞Hep3B、MHCC-LM3和MHCC-97H增殖有更强的抑制作用。平板克隆实验也有相似的结果。RT-PCR结果显示,WM130抑制球体细胞Ep CAM m RNA表达的作用更强,而对肝癌细胞和球体细胞CD133和Oct3/4 m RNA表达的抑制作用无明显差异。以上结果表明WM130能优先抑制肝癌球体细胞。四、苦参碱衍生物WM130体内对肝细胞癌生长的抑制作用(一)WM130对肝癌细胞异种移植瘤生长的抑制作用WM130治疗组(10mg/kg)异种移植瘤的生长速度明显慢于Control组。与WM130或DOX单独治疗组(3mg/kg)比较,WM130+DOX联合用药组对肿瘤生长速度表现出更强的抑制作用。实验结束后,取出肿瘤称重,肿瘤重量与瘤体生长大小的趋势相一致。在整个实验过程(21天)中,WM130治疗组与对照组的裸鼠的平均体重相比无差异,而DOX组裸鼠的体重明显减轻。WM130与DOX合用也没有使裸鼠的体重进一步减轻。表明WM130安全性较高,而化疗药物虽然能抑制HCC生长,但同时也会对机体产生毒性。(二)WM130体内对肝癌干细胞样细胞的抑制作用为了进一步确证WM130体内对肝癌干细胞的作用,我们将异种移植瘤取出后,胰蛋白酶消化,获得的细胞在无血清成球细胞培养液中培养。结果显示,与对照组相比,WM130治疗组瘤块中球体细胞数明显减少,并且WM130和DOX合用组中球体细胞数进一步减少,而DOX治疗组瘤块中球体细胞的数目则明显增加。WM130治疗组和与DOX合用组瘤块中获取的肿瘤细胞的克隆形成能力也相较于对照组明显减弱。RT-PCR结果发现WM130的治疗能显著降低瘤块中肝癌干细胞相关基因Ep CAM的表达水平,增加肝细胞功能相关基因CYP1A3、G-6-P和ALB的表达水平,而DOX却增加了肝癌干细胞相关基因Ep CAM、CD133和Oct3/4的表达水平,降低肝细胞功能相关基因CYP1A3和G-6-P的表达水平。DOX治疗组瘤块中获取的肿瘤细胞的增殖能力明显强于对照组的细胞。DOX对DOX治疗组的肿瘤细胞无抑制作用,而WM130依然能抑制DOX治疗组的肿瘤细胞增殖。五、苦参碱衍生物WM130抑制Wnt/β-catenin信号通路(一)WM130体外对Wnt/β-Catenin信号通路的抑制作用Western blot结果显示,WM130能显著降低Hep3B和MHCC-LM3中GSK3β(Ser9)磷酸化水平,也能抑制β-catenin蛋白及其靶向基因cyclin D1的表达。(二)WM130体内对Wnt/β-Catenin信号通路的抑制作用WM130体内给药能降低MHCC-LM3异种移植瘤块中GSK3β(Ser9)磷酸化水平、β-catenin蛋白及其靶基因Ep CAM蛋白的表达水平。IHC结果进一步证明WM130体内给药也能抑制Wnt/β-catenin信号通路,WM130治疗组的肿瘤组织中β-catenin和Ep CAM蛋白的表达水平明显低于对照组。六、苦参碱衍生物WM130抗肝细胞癌作用与67LR的关系研究(一)抗体封闭67LR对WM130抑制肝癌细胞增殖的作用CCK8结果显示67LR抗体对MHCC-LM3和Hep3B增殖无影响。MHCC-LM3和Hep3B用67LR的同型Ig M抗体预处理,EGCG和WM130能显著抑制MHCCLM3和Hep3B的增殖;67LR抗体预处理MHCC-LM3和Hep3B可使EGCG(40μmol/L)抑制两种肝癌细胞增殖的作用分别减弱24%和30%。67LR抗体同样也能减弱WM130抑制两种肝癌细胞增殖作用,WM130(10、20、40μmol/L)抑制MHCC-LM3增殖的作用分别减弱了21%、45%、48%;抑制Hep3B增殖的作用分别减弱了31%、36%、56%。这些结果说明WM130抑制肝癌细胞增殖的作用至少部分通过细胞膜受体67LR起作用。(二)敲减67LR表达水平对WM130抑制肝癌细胞增殖的作用1、67LR si RNA(100n M和200n M)降低细胞67LRm RNA水平可达50%和75%,细胞内67LR蛋白水平也相应地降低。与NC si RNA相比,67LR si RNA能显著抑制肝癌细胞增殖,对MHCC-LM3和Hep3B细胞的抑制率分别为25%和59%。结果显示,MHCC-LM3和Hep3B转染NC si RNA情况下,WM130(10、20、40μmol/L)能显著抑制细胞增殖,但是细胞转染67LR si RNA后,WM130抑制肝癌细胞增殖的作用完全消失。2、稳定感染Lenti-NC sh RNA和Lenti-67LR sh RNA的Hep3B细胞中,WM130(10、20、40μmol/L)能浓度依赖地抑制稳定感染对照病毒Lenti-NC sh RNA的Hep3B细胞增殖,但对稳定感染Lenti-67LR sh RNA的Hep3B细胞增殖的抑制作用消失。(三)EGCG减弱WM130抑制肝癌细胞增殖的作用EGCG(20μmol/L)与WM130(0、10、20、40μmol/L)共同处理细胞后,EGCG能使低浓度WM130(10μmol/L)抑制MHCC-LM3和Hep3B增殖的作用减弱,但是不改变高浓度WM130(20和40μmol/L)的作用。以上结果提示,EGCG与低浓度的WM130竞争结合67LR,减弱WM130抑制肝癌细胞增殖的作用。高浓度WM130的作用可能与67LR无关,而可能与其促细胞凋亡有关。(四)磷酸二酯酶5抑制剂对WM130抑制肝癌细胞增殖的作用EGCG(20μmol/L)显著增强了西地那非(20μmol/L)对肿瘤细胞增殖的抑制作用,这与文献中报道的结果一致。但西地那非并不增强WM130抑制肝癌细胞增殖的作用。以上结果说明此通路并不是WM130的作用机制。(五)蛋白磷酸酶2A抑制剂对WM130抑制肝癌细胞增殖的作用1、5n M和10n M OA对MHCC-LM3和Hep3B无生长抑制作用,20-100 n M能浓度依赖性地抑制两个肝癌细胞的增殖。并且OA(5~40 n M)预处理显著减弱WM130和EGCG抑制肝癌细胞增殖的作用2、10n M OA可使WM130(10、20、40μmol/L)和EGCG(40μmol/L)抑制MHCC-LM3增殖的作用分别减弱了26%、42%、15%和15%;同样地,OA预处理也使WM130(10、20、40μmol/L)和EGCG(40μmol/L)抑制Hep3B增殖的作用分别减弱了25%、44%、22%和15%。这些结果提示WM130抑制肝癌细胞增殖的作用是部分通过67LR依赖的激活PP2A通路发挥作用的。【结论】1、苦参碱衍生物WM130抑制肝癌细胞增殖和克隆形成。2、苦参碱衍生物WM130优先抑制肝癌干细胞样细胞。3、苦参碱衍生物WM130体内抑制肝细胞癌生长并减少肝癌干细胞样细胞。4、苦参碱衍生物抑制Wnt/β-catenin信号通路。5、苦参碱衍生物WM130部分通过67LR抑制肝癌细胞增殖。


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1 倪晨旭;苦参碱衍生物WM130抗肝细胞癌的作用及其机制研究[D];第二军医大学;2016年
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