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鸦胆子苦素D靶向β-catenin/Jagged1通路抑制肝细胞癌

程紫莹  
【摘要】:原发性肝癌是全球常见的恶性肿瘤之一,肝癌患者5年总体生存率不超过17%,目前针对晚期肝癌的一线用药仍以多重酪氨酸激酶受体抑制剂为主,其中一线抗肝癌药物索拉非尼相对安慰剂来说,仅增加了肝癌患者2.7个月的生存期,且其容易产生耐药性。目前认为,晚期肝癌药物开发策略主要为寻找靶向新通路的分子或寻找索拉非尼增敏的分子。Notch和Wnt通路是介导肝癌发生发展的重要通路,其中Wnt通路的重要转导蛋白β-catenin在肝癌中的突变率达到20-40%。实验室前期通过RBP-Jκ荧光素酶报告基因系统筛选到一个Notch通路的抑制剂鸦胆子苦素D(BD),其能明显抑制Notch通路配体Jagged1的表达,同时对肝癌细胞有明显的抑制作用。在药效评价上,本研究通过肝癌原位移植模型进一步验证BD抗肝癌及与索拉非尼联用的效果;机制上,本研究进一步深入探究BD抗肝癌作用机制,以期为肝癌治疗提供一定的科学依据及先导化合物。研究方法:1、本研究通过裸鼠原位肝癌模型验证BD对肝癌生长作用的影响及联合索拉非尼的治疗效果;通过HE及免疫组化技术测定BD对裸鼠肝原位肿瘤细胞生长的影响;2、通过β-catenin和Jagged1蛋白干扰实验及Wnt通路激活和抑制实验验证在肝癌细胞上β-catenin对Jagged1的调控作用;3、采用免疫共沉淀,q PCR和免疫印迹方法验证BD对Wnt/TCF4信号通路转录活性的影响;4、采用免疫荧光共聚焦和核质分离等方法测定BD对β-catenin核内水平的影响;5、采用免疫印迹实验检测BD对β-catenin及其活化形式总量的影响;采用蛋白合成酶抑制剂MG132处理实验检测BD对β-catenin蛋白酶体降解途径的影响;6、采用Wnt通路激动剂Wnt3a和GSK3β的抑制剂处理后测定BD的作用与GSK3β上游通路的关系。7、采用出核通路CRM1的抑制剂处理测定BD对β-catenin出核过程的影响;8、采用免疫组化和免疫印迹实验检测BD对小鼠肝癌瘤块中β-catenin和Jagged1的影响。9、采用Biacore,MST和Thermal shift技术测定BD与潜在靶标β-catenin的相互作用;研究结果:1、前期研究发现具有体内外抗肝癌活性的天然小分子化合物BD,本研究通过构建稳定表达GFP绿色荧光蛋白的Huh7细胞原位肝癌裸鼠移植瘤模型,进一步评价BD体内抗肿瘤活性。实验结果显示BD(1.5 mg/kg)能抑制肝癌的生长但效果不及索拉非尼(30 mg/kg)给药组,BD(0.75 mg/kg)和索拉非尼(10 mg/kg)单独处理组抗肝癌效果并不显著,但两者联合用药的肝癌抑制作用与索拉非尼(30 mg/kg)高剂量相当。以上结果表明,BD能抑制肝癌生长的同时也能明显增强索拉非尼的抗肝癌作用。HE实验表明BD能诱导原位肝癌中肿瘤细胞的坏死,增强索拉非尼诱导肿瘤细胞坏死的作用。TUNEL实验表明BD能明显诱导肿瘤细胞凋亡,增强索拉非尼对肿瘤细胞的凋亡作用。Ki67免疫组化实验表明BD能明显抑制原位肝癌中肿瘤细胞的增殖作用,增强索拉非尼诱导肝癌凋亡抑制肝癌增殖的作用;2、前期研究表明BD通过下调Jagged1的表达量从而抑制Notch信号通路,且Jagged1是BD抗肝癌的重要效应蛋白,文献调研表明Jagged1是β-catenin的下游靶蛋白。本研究Jagged1和β-catenin质粒干扰实验表明β-catenin表达下调,Jagged1的表达随之下调;Wnt通路的激活剂处理后,β-catenin蛋白水平增加,Jagged1的蛋白水平也随之升高;同理Wnt通路抑制剂处理后,Jagged1的蛋白水平随之降低。上述实验结果表明在肝癌细胞中Jagged1同样受β-catenin调控;3、通过免疫共沉淀实验发现BD能抑制Wnt关键转录因子TCF4和β-catenin的结合,q PCR和免疫印迹实验表明Wnt/β-catenin下游靶基因的基因水平和蛋白质水平均明显下调,结合前期Top Flash报告基因实验,表明BD能显著抑制Wnt/TCF4信号通路的转录活性;4、核质分离实验和免疫荧光共聚焦实验表明,BD能使Wnt关键转录因子β-catenin的核内聚集量显著下调;5、免疫印迹方法检测发现BD能下调肝癌细胞内β-catenin和活化的β-catenin(ABC)的总量;MG132处理后BD下调核内β-catenin蛋白量作用消失,说明BD通过诱导β-catenin的蛋白酶体降解起作用;6、Wnt3a和GSK3β的抑制剂BIO和CHIR99021处理对BD抑制β-catenin的核内聚集无影响,表明BD对Wnt通路抑制作用与GSK3β及其上游通路无关;7、采用CRM1的抑制剂LMB和Selinexor处理对BD抑制β-catenin核内聚集的作用无影响;8、免疫组化和免疫印迹实验表明,BD能抑制小鼠体内Jagged1、β-catenin及其活性形式ABC的表达量。9、细胞内Thermal Shift实验表明,BD在细胞内与β-catenin蛋白并无相互作用。纯蛋白Thermal Shift实验结果亦然;Biacore实验显示BD与β-catenin有结合作用,但实验重复性不佳;MST实验未发现BD与β-catenin蛋白有结合作用;结论:实验室前期结果表明BD有较好的体内外抗肝癌作用,且其主要效应蛋白为Jagged1。本课题研究表明BD在体内亦能抑制原位肝肿瘤的生长,同时能明显增强索拉非尼的抗肝癌作用,可作为目前肝癌一线用药索拉非尼的协同剂。机制研究方面,本课题发现Jagged1在肝癌细胞中受β-catenin调控,BD能通过诱导β-catenin的蛋白酶体降解,抑制β-catenin的核内聚集水平,从而下调Wnt/TCF4的转录水平。综上,本研究发现了一个靶向β-catenin/Jagged1通路转导的抗肝癌小分子,其还能作为索拉非尼抗肝癌的协同增效剂,为肝癌药物开发提供一定的临床前证据和先导化合物。


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