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动脉血管平滑肌细胞钙化的影响因素及其mRNA差异表达的初步研究

王宇玫  
【摘要】:研究背景:动脉钙化在人类中广泛存在,其发生随着年龄的增加而明显 增加;一些疾病可以导致和加重动脉钙化的发生与发展,如冠心病、高血 压、糖尿病、尿毒症和老年人骨质疏松等,而钙化的动脉反过来增加这些 疾病致残和致死率。近年来的研究发现动脉钙化的形成过程与骨骼的矿化 过程相似,是一个主动的调节的过程,一些能够影响骨骼矿化过程的因素 同样对动脉钙化的过程产生影响。90%的动脉粥样硬化病变存在着不同程 度的钙化,而在此过程中的一些细胞生长因子如转化生长因子-β (Transforming Growth Factor-β,TGF-β)和胰岛素样生长因子 (Insulin-like Growth Factor,IGF)对骨骼细胞的矿化有明显的促进作 用,它们对动脉钙化过程的影响研究甚少或者基本上无研究。新近的研究 发现了在动脉钙化形成的过程中有许多基因表达的变化,目前对此方面的 研究多参照骨骼的矿化模式,发现的变化基因多为骨骼相关的细胞分化基 因或骨骼特征性的细胞外间质蛋白,而从整体上研究尚未见报道。 研究目的:从细胞和分子两个水平进行研究:(1)一些影响钙磷代谢的 维生素如维生素D和影响骨骼形成的细胞因子TGF-β和IGF-1对动脉钙化过 程的影响,(2)动脉血管平滑肌细胞在钙化过程中基因表达的变化。 研究方法:本实验用体外培养牛主动脉平滑肌细胞为钙化模型基础, (加入终浓度为10mmol/Lβ-甘油磷酸酯诱导细胞钙化)分别在正常对照 培养的牛主动脉血管平滑肌细胞(BASMC)和钙化培养的BASMC中加入 10~(-9)mol/L的维生素D_3、TGF-β、IGF-1,测定细胞的钙盐沉积、细胞内碱 性磷酸酶和细胞分泌的骨钙素的动态变化情况;并分别将这三种刺激因子 的浓度增加至10~(-8)和10~(-7)mol/L,10天后测定细胞的钙盐沉积情况。提取对 照细胞和钙化细胞的RNA,用mRNA差异显示的方法分析在细胞钙化过 程中细胞的mRNA表达差异变化,分别经过reverse Northern Blot和 Northern Blot的方法鉴定阳性差异条带,进行测序,利用生物信息学的方 法分析差异片段中所含有的信息。 实验结果:在培养的BASMC中加入终浓度为10mmol/Lβ-甘油磷酸 酯,10天细胞培养层出现广泛的点状沉积,逐渐融合成片状,von Kossa 染色证实此为钙盐沉积,细胞层的钙合量较对照增加了23倍,生化分析和 病理鉴定证实了钙化模型的建立成功. 分别在正常对照培养的BMMC和钙化培养的BMMC中加入ic ’mol/L的维生素D3,钙化培养的BASMC的钙盐沉积轻度增加,第 10天的 钙盐沉积量较未加入维生素D3的钙化细胞增加了16.25%(P>0.05),在这 个过程中细胞内碱性磷酸酶活性大幅度增加,以第8天达最高峰,较钙化 对照组增加了Zo176%,第侧天略下降,但是仍比普通钙化细胞增加了 53.90%(P<0.05h 细胞分泌骨钙素较对照组增加 T58.3%;而作为对照 培养的BASMC则无上述改变;增加维生素D3的作用浓度,培养液中维生 素h的贩达lpe和ltwOVL,10天后细胞的钙盐沉积分别较钙化对照组 下降了双*2%和35.89%(下<o.05)。 用 lfr乍/L的 TGF 0分别作用于对照和钙化培养的 BASMC,两组细胞 在TGF-0加入前后的钙盐沉积量无明显的变化,在钙化培养细胞中增加 兀F-p的浓度至lpe和1o’n/L,·细胞的钙盐沉积仍无变化;钙化培养细胞 在加入TGF0后细胞的碱性磷酸酶的活性呈时间依赖增高;培养上清中细 胞分泌的骨钙素的浓度无明显变化.提示碱性磷酸酶虽然在钙化的形成过程 中有重抓用,但弧有碱性磷酸酶的升高不一定导致钙化,TGF 6虽然 增加细胞内碱性磷酸酶活性,但是并禾增加细胞的钙化。 用 lfrgmol/L的IGFl分别作用于对照和钙化培养的BASMC,结果显示 mF-1能够呈时间依赖性增加B ASASMC的钙盐沉积,对普通对照的B ASAS MCMC 无此作用,细胞在钙化的过程中钙盐沉积的增加幅度在第8天达最高 (33.3%),第10天虽继续增加,但是幅度有所下降,第10天的钙盐沉积 较钙化对照组增加了13.N%(P>o.05),在此过程中细胞的碱性磷酸酶活 力大幅度升高,第8天细胞的碱性磷酸酶活性为钙化对照组的133%,第10 天骤然下降,低于对照组;细胞分泌的骨钙素的浓度在第10天较钙化对照 细胞增加 T 79.2凡 增加培养环境中 IGFl的浓度至豆肿和IO7mmol/L,细 胞的钙沉积进一步增加,较钙化对照分别增加了22.7%和40.7%(P叼.05). 上述三种因子对细胞的钙化作用都仅局限于钙化培养的BASMC,而对 作为对照的普通细胞无此作用,反映了它们作用的细胞依赖性,有赖于产 生钙化的细胞;


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