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活性氧对耳蜗损伤的分子机制研究

张欣欣  
【摘要】:线粒体是内源性ROS产生的重要场所,mtDNA由于缺乏组蛋白及DNA 结合蛋白的保护和自身修复系统,在ROS保护酶功能低下或缺乏时,极易 受到损伤而突变。为探讨ROS对耳蜗损伤的分子机制,我们应用分子生物 学技术对Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗及同系野生型CD129/CD-1小鼠耳 蜗mtDNA进行检测,从以下4个方面分别进行论述。 一、Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗mtDNA缺失的检测 目的 缺乏Cu/ZnSOD的保护,ROS对耳蜗mtDNA的影响,在分子水 平揭示ROS对耳蜗的损害作用。方法 应用套式PCR和分子克隆测序技术 对14个Cu/ZnSOD基因敲除纯合突变(Cu/ZnSOD无活性,Sodl-/-)小鼠 耳蜗和 7个Cu/ZnSOD杂合突变(50%Cu/ZnSOD失活,Sod1+/-)小鼠耳蜗 及16个同系野生型(Cu/ZnSOD活性正常,Sodl+/+)小鼠耳蜗进行研究。 结果1.Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗mtDNA有三种缺失,分别为 mtDNA3867bp、mtDNA3726bp、mtDNA4236bp缺失,其中Sodl-/-小鼠和 Sodl+/+小鼠耳蜗 mtDNA易出现 mtDNA3867bp缺失,Sodl+/-小鼠耳蜗 mtDNA易出现3726hp缺失。mtDNA4236bp缺失在三种小鼠中无或不常见。 2.MtDNA缺失发生率及缺失量随着Cu/ZnSOD活性的递减而增加,Sodl-/- 小鼠(分别为100%和 6.284×10~-4)明显高于Sodl+/+小鼠(分别为31.25%和 0.273×10~-4)(p0.01)。mtDNA缺失发生率在Sod1-/-小鼠和Sod1+/-小鼠 (71.43%)之间及Sod1+/-小鼠和Sod1+/+小鼠之间无明显不同,mtDNA缺失 量两组内小鼠比较有显著的差异(p0.01)。结论Cu/ZnSOD对耳蜗mtDNA 具有保护作用,在其功能活性低下或缺乏时,ROS可造成耳蜗mtDNA出现 多处缺失突变,缺失的发生率和含量随着Cu/ZnSOD活性的增加而降低。 r-—一、-J—。“、二、汕一 、—x 二 二,。工。—”趣C,W。冗W。S二FpeZ.x 二”7、_1卜巧一/“, 川Y w.”*b/ 博士后工作报告 中文摘要 8 nlDJon缺失突变导致编码OThHOS酶的活性异常,可能在造成听觉功能 障碍上起到了重要作用。 二、耳蜗是ROS损伤的敏感标靶一lOS损伤mtDNA的组织 特异性研究 目的探讨ROS对各种组织moNA的损伤情况,耳蜗IntDNA是否为 ROS损伤的标靶。方法应用套式 PCR及分子克隆测序技术对 10只 CLI/ZnSOD基因敲除小鼠及5只同系野生型小鼠耳蜗、脑、肝脏、肾脏、脾 脏、心脏及皮肤组织进行研究。结果1.各组织mw可检测到3种缺失, 常见的缺失为mtDN3 867hp和mo狐372柳缺失,IllUj:rvn.arx236’bp缺失不 常见。2.moNA缺失在不同组织的含量有明显的不同,肝脏和肾脏组织含 量最高,耳蜗、心脏和大脑组织其次,脾脏及皮肤组织含量最低。与野生 型小鼠比较,Cu/ZnSOD基因敲除小鼠皿o的A在不同组织的缺失量是野生 型小鼠的 3~20倍,其中耳蜗组织 mtDNA缺失量约是 WT小鼠的 15倍。结 论缺乏Cll/ZnSOD的保护,ROS可以攻击各种组织IntDN,但具有明显 的组织特异性,耳蜗IntDM是其损害的敏感标靶。 三、老龄小鼠耳蜗moNA缺失惰况 目的 探讨老龄小鼠耳蜗moNA缺失情况,明确老龄小鼠耳蜗mtDNA 缺失的位置。方法应用套式PCR和DM测序技术对不同月龄CD129C 杂交小鼠耳蜗31个(2月龄7个,7—10月龄16个,1719月龄8个)进行 定性及定量检测。结果 1.小鼠耳蜗 IntDN3867bp大片缺失,缺失发生在 fit9H~l:1112970 Z间,其两攸 m9089~l:lly103和 m12956ofl:[12970 为核昔酸 完全相同的15hp重复序列。2随着小鼠月龄的增加,耳蜗1llUJfroH6867bD 缺失发生率有明显增加的趋势,2月龄小鼠未发现缺失①厂人17叶9月龄 小鼠0侣)明显高于7~10月龄小鼠(4/16)中<0.01人3.缺失<tD灿总 二 __。__..、、。、。。__r,。_.、__._、。_、。L/_、l、。-兰M。一.!l.Ic、尸卜。、、2呐_/Ws。”V句为 呵 。”卜”)、二\忖“松。。。蚁/议<嚎、耶“C5n三沪豪穹匆才么不/委二/口L大”。”~广。。’尸”。“’,。。。二-’”丫二““厂一 f人。“LU钦二人网/不虫砒琢。一 博士后工作报告 中文摘要 a IntDNA比值,17叶9月龄小鼠明显高于710月龄小鼠(<0.01人 结论老 龄小鼠耳蜗出现 ]:I]:ln-wtyM.--867bp大片缺失可能与老年性聋发生密切相关。 四、耳蜗铡损伤模型的确立 目的确定一?


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