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人纳/二羧基转运蛋白1的融合表达及其在肾结石发病中的作用

何娅妮  
【摘要】:人钠/二羧基转运蛋白1(hNaDC1)基因的编码产物是一种负责转运枸橼酸、琥珀酸及 a-酮酸等三羧酸循环中间产物的跨膜有机阴离子转运蛋白。它不仅参与能量代谢,与 氨基酸以及糖皮质激素的合成也有密切关系,新近研究发现它可能是参与调控哺乳类 寿限的重要基因之一。在肾脏,hNaDC1是决定尿枸橼酸浓度的关键环节。枸橼酸不仅 是机体多种代谢反应的重要底物,而且还是尿液中内源性结石抑制物。因此研究hNaDC1 的生物学功能及其与疾病的关系具有十分重要的意义。但由于迄今仍未获得全长 hNaDC1蛋白及其相应的抗体,使hNaDC1病理生理意义的研究尚不深入。我们通过对 hNaDC1理化性质及抗原表位的分析预测,首次以融合蛋白形式高效表达hNaDC1氨基端 抗原表位区,并制备了融合抗体,旨在进一步研究hNaDC1的功能及病理生理意义。方 法:利用互联网上软件http//expasy pku edu cn/cgi-bin/protparam,分析蛋白理化 性质和二级结构,预测hNaDC1抗原表位,确定融合表达的hNaDC1cDNA片段。RT-PCR 获取插入 cDNA片段,EcoR I和 Sal I酶切后插入到融合蛋白表达载体 PGEX-5X-1中, 构建PGEX-hNaDC1表达载体。DNA测序鉴定阳性重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌, IPTG诱导表达,超声破碎细胞后,采用亲和层析方法纯化表达产物。以此为抗原免疫 新西兰白兔制备抗hNaDC1抗血清,并以亲和层析除去抗GST抗体。Westem blot及免 疫组化方法鉴定抗体特异性。结果:DNA测序证实PGEX-hNaDC1含有hNaDC1基因 的第474-725核苷酸序列,编码136-219位氨基酸,阅读框架正确。在宿主菌BL21中 表达出37KD的可溶性GST-hNaDC1融合蛋白,薄层扫描显示融合蛋白占菌体总蛋白 的37%。表达产物经GST亲和层析纯化后,用以免疫新西兰白兔。ELISA检测抗hNaDC1 29 抗体血清效价为 1:20000。West6mbl拉表明,抗hNaDCI融合抗体可特异性识别36KD 的重组hNallCI融合蛋白。免疫组化进一步证实,抗hNaDCI融合抗体可特异性结合于 人及大鼠近端肾小管刷状缘,表明该抗体可识别天然 hNallC蛋白。至此,我们成功制 备了抗 hNaDC融合抗体,为进一步研究 hNlC基因的功能及病理生理意义奠定了基 础。


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