自体骨髓基质细胞体外培养促分化及经皮注射修复兔骨缺损的研究

【摘要】：骨缺损的修复是骨科临床的重要课题。目前修复方法是手术植入自体骨、异体骨及各种人工修复材料，均有不足之处。随着组织工程和细胞外科的发展和应用，成骨细胞和骨生长因子的局部移植成为研究的重点。骨髓基质细胞因能在体外增殖并分化为成骨细胞，移植后直接增加缺损区成骨细胞数量，改善局部成骨能力，使得基于细胞的骨修复技术成为该研究领域中新的希望。为寻找一种有效、微创的治疗方法，本研究采用组织工程学原理，将自体MSC与BMP复合经皮移植修复骨缺损，并对其作用与机制进行了探索。 方法 1．骨髓基质细月包的动员和培养：随机选取新西兰兔一侧胫骨抽取骨髓1ml进行培养，对侧在G-CSF 2.5ug／kg连续静脉注射5天后抽取骨髓；利用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况，计算克隆形成率；并且观察细胞的ALP活性和钙化结节形成情况。 2．多种生长因子对骨髓基质细胞增殖分化的影响：分别以50、100ng／ml浓度的BMP、bFGF、G-CSF作用于骨髓基质细胞，检测细胞增殖速度及细胞的ALP活性，比较不同因子的效应、同因子不同浓度的效应以及各因子相互组合后的效应。 3．经皮注射骨髓基质细胞和BMP修复骨缺损的研究：(1)兔骨缺损制备：无菌条件下切除双侧连同骨膜在内的桡骨干15mm，形成标准骨缺损模型；(2)术后24小时，经皮将体外扩增的基质细胞悬液0.5ml(细胞数量达5×10~6)注射到骨缺 2002年硕士研究生毕业论文骨科 解放军军医进修学院 一 损处；门）术后分别于2、4、8周行X线、组织病理学检查。 采用光镜、组化染色、图象分析等方法检测骨缺损修复的程度。 结果 1．兔骨髓基质细胞能够在培养条件下形成集落并持续扩 增，其中部分集落碱性磷酸酶表达阳性，细胞接近汇合时有近 半数ic胞有ALP活性表达；汇合后能够形成钙化，J、结；G－CSF 虽能够增加骨髓中有核细胞数量，但克隆形成率并未有明显增 力。。 2．随rhBMP齐量增高，MSC内ALP活性显著增力。，bFGF 剂量增高可显著促进MSC的增殖（OD值升高），二者合用以 ALP升高为主。 3．X线、组织病理切片表明BMP＋MSC组术后2周有明显 的骨痴生成，术后48周连续性骨痴桥接骨缺损，与单纯注射 骨髓组有显著性差异。 结论 1．G－CSF对MSC的数量无明显动员作用。 2．BMP和bFGF能够促进MSCS大量扩增并定向分化为成 骨细胞的能力，符合作为骨组织工程种子细胞的要求。 3．证实了3＊P在体夕！、促进细胞间通讯和增加增殖期细胞 比例的作用能够在体内表达，直接促进局部骨修复能力。 4．实验表明经皮注射自体MSC＋BMP能够促进兔挠骨缺 损处新骨形成，疗效优于新鲜骨髓。