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人胃癌中Survivin基因的克隆与功能研究

杨欣艳  
【摘要】: 目的 凋亡抑制基因survivin(SVV)自1997年发现以来即引起了国内外学者的广泛关注。大量研究阐明了其高表达与肿瘤的相关性,SVV基因也被认为是可靠的肿瘤标志物。但其在人类恶性肿瘤发生、发展中的生物学功能尚未阐明。国内外也尚未见有自胃癌细胞中克隆SVV基因的报道。因此,我们拟从人胃癌细胞中克隆SVV基因,并研究其在胃癌发生发展过程中的生物学作用。 方法 1.RT-PCR技术自人胃癌细胞SGC7901中克隆Survivin基因。 2.将所获片段克隆入pGEN T-Easy载体,EcoR I酶切鉴定。分析插入片段的序列,通过BLASTN、BLASTP与GeneBank数据库进行同源性比较,确定所获SVV基因克隆的正确性。 3.将经过测序证实的SVV片段两端加入限制性内切酶Nde I和BamH I识别位点,并克隆入原核表达载体pRSET,实现其在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达。 4.根据所获SVV片段序列设计引物,扩增得到相应的正向SVV序列(SW-a)及反向SVV序列(SVV-b),两端分别引入限制性内切酶EcoR I和BamH I识别位点,克隆入真核表达载体pEGFP-N1。 5.将含SVV正向序列的阳性重组子克隆瞬时转染人胃癌细胞SGC7901。激光共聚焦技术检测SVV基因转染胃癌细胞后的细胞内定位。 解放军总医院 博士学位论文 军医进修学院 人胃癌中Survivin基因的克隆与功能研究 6.将重组子克隆稳定转染人胃癌细胞SGC7901、MI{N45和小鼠NIH3T3细胞。 对于经过G418筛选的阳性转染细胞克隆,检测其转染前后的细胞生长曲 线、细胞增殖周期的改变;TUN’EL技术检测细胞凋亡的变化;免疫组化技 术检测PCNA表达的改变;MI7法检测对化疗药物5-u、VP16的敏感性改 变等。 7.根据SW片段序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法对5例胃癌、l例肝 癌标本及白血病细胞HL60、结肠癌细胞HT29进行检测。 8.用原位杂交分析SW基因两种剪切形式SA与S凸在胃癌、结肠癌、前列 腺癌、肺癌及乳腺癌等组织中的表达,标本为进展期胃癌手术标本的石蜡 包埋组织61例、结肠癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌手术或活检标本的石 蜡包埋组织各2例。采用图像分析软件,以平均光密度值为指标,量化 SW基因在不同组织的表达程度。 结果 1.获得人SW基因的全长CDNA片段一S4A。 2.经序列测定、核昔酸序列比对,证实所获片段批与SW基因己知序列完 全一致。同时,得到一较印 少11 gbP的片段-SS,经BLASTN. BLASTP与 GeneBank数据库进行同源性比较,表明S刀较SW完整序列缺失第三个外 显子,编码137个氨基酸的蛋白质。该蛋白质的氨基酸序列与SW基因的 蛋白质产物高度同源,故称SS为SW基因的变异体。 3.实现了 SW基因在大肠杆菌 BLZI(DE3)中的高效表达。 4.经测序证实,SW基因的正向与反向序列正确地克隆入真核表达载体 pEGFP-NI,分别命名为pEGFP-NISVV--a和pEGFP-NISW-b。 4 解放军总医院 博士学位论文 军医进修学院 人胃癌中Survivin基因的克隆与功能研究 5.含SW基因正向序列的阳性重组子瞬时转染人胃癌细胞SGC7901后,激光 共聚焦显示,SW基因转染成功,并且表明,SW基因在胃癌细胞的细胞浆 中表达。 6.含SW基因正向与反向序列的阳性重组子转染人胃癌细胞SGC7901、Wb45 及小鼠叮H盯3细胞(Nm3H细胞仅转染含正向SW片段的重组子),经 G4筛选获得阳性转染细胞克隆。上述稳定转染细胞的生长曲线观察显 示:转染SW正向序列即pEGFPWI-SVV-a者,细胞的生长速度明显快于转 染空载体P巳干PNI者,而转染反向序列PEGFPWI-SW-b者,其细胞生长 速度则减慢;细胞增殖周期检测显示:转染pEGFP-NISVV--a者,出现GW 和/或 S期细胞比例的增加,而转染 PEGFP-NISVV--b者则表现为 GW和/或 S期细胞比例的减少;T[JNEL技术检测转染前后细胞凋亡与免疫组化检测 PCNA表达均未发现显著的变化。fIT法检测转染SW基因前后的体外药物 敏感实验也未发现显著变化。 7.根据SW基因序列设计特异性引物,RT-PCR结果显示,SW基因在5例人 胃癌


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