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体外循环前后心肌及外周血单个核细胞细胞因子基因表达谱的初步研究

齐弘炜  
【摘要】: 目的:探讨基因芯片技术在心血管外科临床及科研中的应用价值。应用表达谱基因芯片筛选体外循环(CPB)前后心肌组织及外周血单个核细胞(PBMC)的差异表达基因,应用半定量逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)在临床验证结果的可靠性。对候选基因及其蛋白功能进行初步分析及预测,为CPB炎性反应的研究提供线索,揭示普遍存在的炎症反应中起作用的细胞因子,以期发现调节炎性反应的可能位点,为药物研究和临床干预提供线索,并为下一步工作打下基础。 方法:选择在CPB下行心内直视手术的住院患者,于CPB开始及CPB结束即刻取右房组织,液氮冻存;于CPB开始及CPB结束即刻抽取动脉氧合血,应用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。用TRIzol Reagent一步法提取标本总RNA。按BD Atlas~(TM) cDNA Expression Arrays说明书操作:合成cDNA探针,柱层析法分离cDNA探针,cDNA探针与BD Atlas~(TM) Array杂交,cDNA探针漂洗。芯片磷屏显像、扫描,应用AtlasImage1.01a软件对扫描结果进行分析处理,对照BD Atlas~(TM) Gene Lists Version 5.0总结分析。用半定量RT-PCR对侯选基因进行临床验证,应用生物信息学技术对筛选出的基因及其蛋白功能进行初步分析。 结果: 1.首次将基因芯片技术成功应用于CPB研究。表达谱基因芯片可平行、快速、大量检测CPB前后基因的差异表达。基因芯片结果与半定量RT-PCR结果不完全相符,甚至相反。BD Atlas~(TM) cDNA Expression Arrays可重复使用至少3次,重复使用使芯片背景增强,影响芯片结果,3次以内使用结果可靠。 2.首次得到CPB前后心肌细胞因子基因表达谱,CPB前后心肌细胞 摘要 博士研究生论文 因子存在差异表达。芯片结果显示白细胞介素一6(IL-6)、Y一干扰素(IFN- a)及 Wntsa表达降低,RTPCR证实均表达增强。IL一门和 GIP3芯片结 果为表达增强而RTPCR无明显差异。肿瘤坏死因子受体超家族成员IB (TNFRSFX 胎盘生长因子(PIGF)和 MFNG H者结果一致,均显示 表达增强。心肌细胞因子差异表达基因的数量及差异程度均高于PBMC。 3.首次得到CPB前后PBMC细胞因子基因表达谱,CPB前后PBMC 细胞因子存在差异表达。芯片结果显示IL-6表达降低,Wntsa表达增强, 而RTPCR未发现二者明显变化。 4.CPB 前不同组织的基因表达谱不同。其中差异明显者有IL-6、 Wntsa禾口 discoidin domain receptor family,member 2。 5.CPB后不同组织的基因表达谱不同。其中差异明显者有PIGF和 Wntsao 6.CPB后心肌内与炎症及免疫调节有关的细胞因子 IL-6和 IFN-Y表 达增强,IFN-Y为首次发现。 7.首次发现 CPB中诱发炎症反应的重要因素肿瘤坏死因子.a(TNF. u)的受体 TNFRSF表达增强。TNF一口比其它己知的促炎性细胞因子 有更强的心肌作用,可影响心脏功能及心肌活性。 8.首次发现CPB后IFN一口的下游效应物质GIP3表达,目前未发现 明显差异。 9.首次发现CPB后与发育、细胞增殖、分化及肿瘤发生有关的PIGF、 Wntsa和 MFNG表达增强。 10.8条表达增强的细胞因子中有 3条与信号转导有关:TNFRSF、 Wntsa和 MFNG。 11.GAPDH表达丰度高,稀释10倍后作为内参照基因得到满意结果。 PBMC中细胞因子表达丰度低,PCR应增加循环数。 12.同管扩增与不同体系内进行 PCR均得到满意结果。初步观察结 一6- 摘要 博士研究生论文 果一致。 结论: 1.基因芯片技术在CPB后细胞因子变化的研究中有一定应用价值。 表达谱基因芯片的初步筛选作用,能鉴别出CPB后的差异表达基因,这 些基因可能参与了CPB引起的炎性反应及其他病理生理反应。 2.目前基因芯片结果并非完全可靠,尚存在假阳性及假阴性问题。 完全有必要对其结果进行验证。结合应用半定量RTPCR可得到可靠的结 果。 3.CPB后心肌及PBMC细胞因子发生差异表达,心肌的变化程度高 于PBMC,心肌组织可能是CPB中细胞因子的主要来源之一。CPB前及 CPB 后人体不同组织细胞因子的表达谱不同,不同组织对心脏直视手术 的反应不同。 4.CPB后心肌 IL-6、IFN-Y、TNFRSFIB、PIGF、Wntsa和 MFNG 表达上调。GIP3有表达增强趋势,但目前未发现明显差异。 5.CPB诱导参与炎性反应及免疫调节的细胞因子高表达,IL-6蛋白 产物参与了 CPB后的炎性反应。ILl 3及 IFN-Y在 CPB中的变化规律及 作用尚无定论,值得进一步研究。 6.CPB后IFN.口的下游效应物质GIP3表达,其功能及在CPB中的 变化规律及作用尚不明确,有待进一步研究。 7.CPB后心肌组织中 T


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