收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

PC12神经元与原代皮层神经元建立功能性突触样连接

周涛  
【摘要】: 中枢神经系统(central nervous system,CNS)轴突损伤的修复是医学的重大课题之一。在以往的观念中成年哺乳动物的神经元和轴突没有再生能力,这是中枢神经轴突损伤难以修复的主要原因。轴突修复包括两个方面:轴突的再生和神经元的再生。随着许多可用于神经移植的细胞的发现和对成年动物中枢神经系统可塑性的再认识,细胞移植治疗CNS损伤和变性已经成为研究热点。多种细胞已经被用于基础研究和临床治疗中,其中最常用的神经元来源于未成熟的细胞及其前体,包括胚胎组织、细胞系和干细胞。目前,中枢神经系统具有可塑性作为基本的理论已经被广泛接受,新的观念认为不但神经元和它们的突起可以重新排列,并且在一生中都可以产生新的神经元加入神经网络。这就使得一种设想成为可能:植入的神经元加入到宿主神经元形成的神经网络中,修复由于神经变性和损伤导致的神经功能的缺陷。虽然已有很多研究着眼于移植神经元的长期存活和分化,但少有研究关注移植的由前体细胞改变表型得到的神经元样细胞在宿主中的成熟程度以及它们能否和宿主神经元形成功能性连接,特别是突触连接。PC12未成熟的神经元细胞系,它可以在神经生长因子(NGF等)的作用下诱导分化为神经元样细胞,形成神经突起和突触样连接,被广泛用于研究神经营养因子的作用和神经元分化。以往研究表明PC12细胞在宿主脑内可以存活12个月以上,但PC12细胞在宿主体内的具体分化情况还不清楚,即它们能否在宿主环境下诱导分化为神经元样细胞并与宿主神经元之间形成突触连接。为此,我们建立了体外原代神经元和诱导的PC12 博士学位论文3 细胞体外共培养模型,在此模型中诱导 PC细胞分化为神经元 并长出神经突起,而且能与原代神经元形成突触连接。 第一部分原代神经元分离及与转染绿色荧光蛋白的PC12 细胞共培养模型建立 皮层原代神经元的分离培养:取新生 12 ,J’时以内的 WIStal大鼠, 分离皮层,胰蛋白酶消化后进行有血清培养;4-5天后,加入阿糖 胞昔杀死分裂细胞,继续培养10天左右接种细胞,经6-12小时细 胞贴壁,呈圆形或者椭圆形,细胞周围有明显的光晕。2-3天后,细 胞明显增大,突起数增多且不断伸长。加入阿糖胞昔杀死分裂细胞, 漂浮起来形成细胞团。然后除去阿糖胞昔,继续培养10天左右, 镜下神经元的细胞核和核仁清晰可见,神经突起多而粗大,网络稠 密。 稳定表达绿色荧光蛋白的PC12细胞的制备:大鼠的嗜铬细胞瘤细 胞来源的未成熟的细胞系(PC12 cell)ffi含 10%马血清和5%胎牛血 清的 DMEM饲养,将增强绿色荧光蛋白的质粒 DNA(EGFP-N vectof)转染到 PC12细胞中,经 G418筛选获得稳定表达EGFP的细 胞。转染4周后,可得到近100o表达EGFP的PC12细胞亚克隆。 共培养模型的建立:收获上述获得稳定转染的 PC细胞,细胞悬 液按照 IX10‘pC12/每皿的密度植入原代神经元的培养皿,用包含 2%马血清的***M饲养,4天后加入阿糖胞昔去除未分化细胞。 第二部分:NGF诱导的PC12细胞分化及与原代神经元 之间的突触形成 NGF诱导的PC12细胞分化:PC12种植到原代神经元后将NGF(25 "g/ml)加入培养液,PC随即长出神经突起,突起的长度和数量 均不断增长,PC细胞分化为神经元样细胞。 博士学位论文4 FMIJ3荧光造影:高钾离子的去极化刺激30 mM external K+,60 s,Klebs-ingCr buffer)使突触末端囊泡被 FM143*0 pM)染色, 细胞固定后在共聚焦激光扫描显微镜下观察,电子图像显示出活性 的突触末端。可以发现 PC细胞分化来的神经元与周围的原代神 经元形成功能性突触,显示为FM143亮点。 免疫电镜:细胞经4%多聚甲醛和0刀5%戊二醛固定,酒精梯度 脱水后包埋于 Epon slZ(含 DMP)中,然后用偶联 IgG的、直径 10 urn的胶体金颗粒对 GFP进行兔疫标记。电镜下可见带有金颗粒 并包含嗜铬颗粒的 PC细胞和原代神经元的突起之间,以及原代 神经元胞体和 PC细胞伸出的神经突起之间形成突触连接,突触 的各个结构清晰可见。 结论:移植神经元细胞能否和宿主神经元建立突触连接是移植 治疗的基本问题。本实验结果显示在体外神经前体细胞乃 PC 细胞)在诱导分化剂(如 NGF)作用下改变表型形成的神经元样细 胞可以和原代神经元建立突触连接,这证明细胞移植治疗修复轴突 损伤等中枢神经系统疾病是可能的,并为研究移植细胞与宿主之间 的相互联系和作用提供一个简单、有效的平台。


知网文化
【相似文献】
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 徐侃彦;熊缨;杜雨苍;;AVP_(4-8)对原代神经元CCT的影响及可能机制[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
2 丛伟红;生立嵩;林成仁;郭德海;刘建勋;;人参、银杏叶提取物对Aβ1-40诱导的大鼠原代神经元凋亡的保护作用[A];2011全国老年痴呆与衰老相关疾病学术会议第三届山东省神经内科医师(学术)论坛论文汇编[C];2011年
3 严乐勤;沈建中;沈波;魏尔清;;氟哌啶醇对大鼠离体海马脑片和原代神经元缺糖/缺氧或NMDA损伤的保护[A];中国药理学会第十届全国神经学术会议暨浙江省药理学会2002年年会论文摘要集[C];2002年
4 柳忠辉;台桂香;方琳;葛敬岩;刘海岩;于昉;;激活素A促进背根神经节神经元存活、神经突起生长作用及其机制研究[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年
5 赵永波;吴云成;蔡友庆;费俭;;核受体相关因子1表达下调对多巴胺能细胞酪氨酸羟化酶和神经突起生长的影响[A];第九次全国神经病学学术大会论文汇编[C];2006年
6 杨浩;王春婷;李静雯;鞠躬;;Thymosin-β4通过激活L1的表达促进神经元的存活和突起生长[A];中国神经科学学会第六届学术会议暨学会成立十周年庆祝大会论文摘要汇编[C];2005年
7 杨晓勇;滕俊琳;陈建国;;MAP2c诱导产生的微管束具有药物稳定性但没有冷稳定性[A];第九次全国电子显微学会议论文摘要集(Ⅰ)[C];1996年
8 何巍;王梦令;刘路英;魏尔清;;米诺环素对大鼠原代神经元和海马脑片缺氧缺糖及NMDA损伤的保护作用[A];第十一届全国神经药理学术会议论文摘要集[C];2004年
9 吴云成;赵永波;;核受体相关因子1的功能研究及其调控相关基因的筛选[A];2009全国抗衰老与老年痴呆学术会议论文汇编[C];2009年
10 吴云成;赵永波;;核受体相关因子1的功能研究及其调控相关基因的筛选[A];2011全国老年痴呆与衰老相关疾病学术会议第三届山东省神经内科医师(学术)论坛论文汇编[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 周涛;PC12神经元与原代皮层神经元建立功能性突触样连接[D];中国人民解放军军医进修学院;2003年
2 杨怡;自噬在神经突起退化过程中的作用及自噬溶酶体在突起内的动力学研究[D];浙江大学;2010年
3 樊拥军;OMgp不同结构域在神经突起生长抑制中的作用研究[D];浙江大学;2004年
4 于芙蓉;帕金森氏病病变的机理研究与分子伴侣的保护作用癫痫相关基因的功能研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2003年
5 杨静文;3,5,3’-三碘甲状腺原氨酸对有丝分裂后神经元的影响[D];中国人民解放军军事医学科学院;2012年
6 余利红;神经突起导向因子NETRIN-4与NNAT的相互作用及其表达相关性研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
7 方琳;激活素A促进鸡胚背根神经节神经突起生长作用及其机制研究[D];吉林大学;2008年
8 龙慧;GRK在细胞周期和神经元发育中的作用[D];复旦大学;2009年
9 程岗;白藜芦醇对神经元氧糖剥夺/复氧模型基质金属蛋白酶9表达的调控机制研究[D];第四军医大学;2009年
10 吴云成;核受体相关因子1的功能研究及其调控相关基因的筛选[D];复旦大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 马琳;磁刺激对海马及中脑原代神经元突起生长的影响[D];河北医科大学;2010年
2 杨艳;肌球蛋白X对神经轴突生长的调控[D];东北师范大学;2009年
3 王一奇;建立整体、细胞水平客观、高效药效评价模型[D];浙江大学;2003年
4 张峪涵;人类神经突起因子真核表达系统的构建及功能的初步研究[D];石河子大学;2005年
5 彭谨;不同结合状态硫酸软骨素B对三维培养的鸡胚背根节神经元突起生长影响的机理研究[D];四川大学;2007年
6 杨瑶斐;IL-6受体的存在方式对神经元IL-6信号转导的影响[D];浙江大学;2008年
7 何巍;米诺环素对大鼠原代神经元和海马脑片缺氧缺糖及NMDA损伤的保护作用[D];浙江大学;2004年
8 沈晗;ERK通路、P53/P21和CDK5/P35在NGF诱导的PC12细胞分化中可能作用的研究[D];武汉大学;2005年
9 刘花香;HIVgp120和二脱氧肌苷对背根神经节神经元毒性作用的实验研究[D];山东大学;2008年
10 唐娟;人类Neuritin在原核细胞中的克隆、表达及相关生物学功能的研究[D];石河子大学;2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 钱铮;影响神经细胞突起形成的蛋白质被发现[N];医药经济报;2006年
2 许文范;衰老与大脑有关[N];中国医药报;2001年
3 张田勘;余志平;嗅觉机理研究获诺贝尔奖[N];中国医药报;2004年
4 张田勘;“闻香识女人”的奥秘[N];河北日报;2004年
5 董映璧;绿茶能促进脊髓神经元复活[N];科技日报;2004年
6 金利;基因工程国家一类新药haFGF获证书[N];科技日报;2007年
7 袁 直;生物钟讨厌“开夜车”[N];大众科技报;2005年
8 杨静;胡德荣;上海学者提出神经突触蛋白转运新模式[N];中国医药报;2004年
9 记者 韩璐;“神经生长因子”获国家一类新药证书[N];科技日报;2001年
10 记者 葛进 陈超;两基因可防脑内“误删除”[N];科技日报;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978