TGF—β1对肝细胞再生分化及凋亡的调控作用机制

【摘要】： 背景 转化生长因子β1被认为是典型的多功能细胞因子，参与调节重要的细胞功能诸如增殖、分化以及组织增生、免疫等基本的生理作用。近来发现TGF-β1还有一个重要的功能，它可以抑制多种人类肿瘤的生长。对TGF-β1敏感性的丧失据认为是肝硬化及肝癌的重要致病因素。阐释肝细胞生长与凋亡调控的分子和细胞学机制，也许能为肝脏疾病的防治提供新的思路。 目的 本研究旨在明确正常和硬化肝细胞及肝癌细胞中TGF-β1的作用及其与凋亡的关系。正常肝细胞是否比硬化肝细胞对TGF-β1诱导的凋亡更为敏感?TGF-β1是否能够诱导肝癌细胞发生凋亡?在TGF-β1诱导的凋亡信号转导通路中，p53和Smad以及caspase各自扮演何种角色? 方法 通过50％CCL_4腹腔注射，用8W时间诱发BALB／c小鼠形成肝硬化模型。应用改良的胶原酶原位灌注法分离正常和肝硬化小鼠的肝细胞。利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯形条带来观测TGF-β1诱导的凋亡。为检测TGF-β1(5ng／ml)及caspase诱导的凋亡，应用DNA荧光染料Hoechst 33342对肝细胞核进行了染色，并在荧光显微镜下观察比较caspase-3和caspase-8在TGF-β1诱导的凋亡中的作用。本研究选用了三种含有不同p53基因状态的人肝癌细胞系，应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)对TGF-β1诱导的肝癌细胞的凋亡进行了定量检测。为明确凋亡机制，对上述细胞系还进行了荧光素酶定量检测。首先应用LF2000把含有Smad结合元件和荧光素酶 中国人民解放军总K院博士研究生论t3 基因的TGF小l可诱导的荧光素酶报矢质粒对细胞进行了转染，后经 TGF小 作用，分别检测其相对荧光素酶活性。 结果 小鼠经CCL。注射后肝脏表面出现细小结节，镜－下呈现肝硬化的 组织学特征。本研究建立了原代肝细胞分离培养的稳定方法。正常肝细 胞予以TGF－pl处理后，应用1．5％的琼脂糖凝胶电泳可以发现具有凋亡 典型特征的梯形条带。与之相比，硬化肝细胞则很少出现梯形条带。经 TGF－pl处理的正常肝细胞应用Hoechst染色后，其凋亡率明显高于未处 理组，两组具有明显的差别。门凋I＼IJ以被 caspase－3和 caspase－8抑吊 剂阻止。在应用TU’NEL检测的三个细胞系中，TGF－pl仅能诱导HepGZ 细胞（野生型p53）凋亡，而Hub7（突变型p53）和Hep3B细胞（缺失 型 p53）则凋亡较少。荧光素酶检测提示 HepGZ细胞对 TGF下 反应较 强，而Hub7和 Hop3B细胞其荧光素酶的表达较低。这提示凋亡与 Smad 以及p53的表达具有明确的联系。 结论 硬化肝细胞不易出现TGF－pl诱导的凋亡，提示硬化肝细胞的 抑吊性生长调控机吊已受损。TGF－pl通过caspase－8和caspase－3的活化 诱导凋亡产生。值得关注的是HepGZ细胞比Hubj和HCp3B细胞更易发 生TGF－pl诱导的凋亡，TGF－pl通过p53依赖性途径诱导肝癌细胞系 发生凋亡。Smad4是TGF小 信号转导途径的主要调控因于之一。总之， ＊GF小回对肝细胞的增殖及分化具有重要的作用。发生肝硬化时肝细胞 的生长受到了损害，其中的可能原因是硬化肝细胞不能象正常肝细胞那 样发生凋亡，而这种凋亡能力的丧失也许可以部分解释在肝硬化患者中， 肝细胞癌的发生率也比较高的原因。