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Toll样受体4在内毒素诱导的小鼠心肌炎症因子表达和左室功能不全中的作用

程姝娟  
【摘要】:目的 内毒素,又称为脂多糖(LPS),是革兰氏阴性菌的主要致病成分,常常可以引起心功能不全等严重并发症而影响患者预后。LPS引起心功能不全的分子机制尚未完全阐明。炎症因子TNF-α和IL-1β的过量表达是LPS引起心功能抑制的重要原因之一,然而,LPS诱导心肌局部炎症因子产生的分子机制也尚属未知。TLR4是近年新发现的LPS受体,在LPS的胞内信号转导过程中起重要作用。本研究旨在探讨TLR4在LPS诱导的心肌局部炎症因子表达过程中以及心功能抑制发生中的作用。 材料和方法 1、以雌性TLR4突变型小鼠C3H/HeJ和野生型小鼠C3H/HeN为研究对象。通过腹腔注射纯化LPS(5mg/kg,n=5)的方法,建立小鼠内毒素血症模型。对照组小鼠腹腔注射无LPS生理盐水。在24小时内定期观察小鼠的整体反应,评价注射LPS(25mg/kg)36小时后小鼠(n=10)的生存率。LPS注射2小时检测小鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1β的含量(n=5),6小时后检测小鼠血清中的BUN、Cr、AST和血糖浓度(n=5),24小时后检测动脉血气(n=5)。用RT-PCR方法从C3H/HeJ小鼠心肌中扩增出包含TLR4突变点的DNA片段,产物进行基因测序。 2、用RT-PCR和免疫组织化学方法对LPS注射前后C3H/HeJ和C3H/HeN小鼠心肌中TNF-α、IL-1β基因和蛋白水平的表达以及TLR4在LPS注射前后的变化进行检测(n=5)。做HE染色,进行常规组织检查了解炎症细胞浸润情况。 3、用改良的心室穿刺测压法即经膈左心室穿刺测压法进行小鼠血流 中国人民解放军总医院 博士学位论文中文摘要 军医进修学院 动力学监测。常规HE染色及Masson染色进行小鼠心肌形态学检查(n=5)。 以注射生理盐水的C3H沮eN小鼠为对照,对LPS注射前和注射后 (25m叭9)6小时的c3H/HeJ和C3H舰eN小鼠的心率、左室最大收缩压、 左室舒张末压和+dP/d标axand一dP/d编ax进行监测(n=5)。 4、统计处理数据用均数士标准差表示。用SPSS10统计软件包进 行统计处理。LPS注射前后血生化指标和血流动力学指标的差异用不配对 t检验,LPS诱导的不同时间点炎症因子表达之间的差异用单因素方差分 析(One一w盯analysis of varianee,ANoVA)。尸0.05表示差异具有统计学 意义。 结果 1、腹腔注射LPS后半小时,C3H旧eN小鼠开始出现全身毒性反应如 毛发竖立、呼吸困难、腹泻以及体重减轻。50%的C31叮HeN小鼠在LPS 注射36小时后死亡。LPS注射后2小时,C3lUHeN小鼠血清中TNF一a、 IL一lp浓度明显增加。6小时后,小鼠血浆BtjN,Cr, AST和血糖明显升高, 表明小鼠器官功能轻度受损和代谢紊乱,24小时动脉血氧分压、血氧饱 和度、HCO3一及pH值降低,提示小鼠出现低氧血症和代谢性酸中毒。上 述指标的变化提示LPS已引起小鼠出现明显的全身炎症反应。在观察期 间,C3曰HeJ未出现任何异常表现,表明其对LPS耐受。Rl’- PCR产物基 因测序结果证明本研究所用C3牙HeJ小鼠存在TLR4基因突变。 2、RJ)PCR和免疫组化研究结果显示,TLR4在小鼠心肌中表达。LPS 注射后24小时,C3H/HeN小鼠心肌上TLR4 mRNA和蛋白的表达明显增 加。而C3H任IeJ小鼠心肌未出现TLR4表达的上调。注射LPS后,C3H/HeN 小鼠心肌上出现TNF一a和IL一lp时间依赖性的快速表达,TNF一a mRNA 的表达在LPS注射后半小时达到高峰,随后很快检测不到,而IL一1 p mRNA 的表达则在2到6小时间保持一个高峰,持续24小时仍然可以检测到少 量。二者蛋白的表达也表现了类似的时间曲线,高峰分别在LPS注射后2 小时和6小时。HE染色显示注射LPS后6小时,C3ll/HeN小鼠心肌组织 中国人民解放军总医院博士学位论文中文摘要军医进修学院 出现大量具有分叶核的炎症细胞浸润,它们主要集中在心肌组织的小血管 周围。C3H/HeJ小鼠心肌上未检测到任何炎症因子的表达,也未观察到炎 症细胞的渗出。 3、用经腹腔经隔左心室穿刺法对小鼠的血流动力学进行了监测。该 方法是对开胸心室穿刺测压方法的改良,既保留了它的敏感性,而又具备 操作简便、出血少和重复性好等特点,对于不连续的血流动力学观察可以 作为一种选择。TLR4突变及TLR4野生型小鼠心肌的HE染色及Masson 染色显示,两种小鼠基础状态下心肌组织无形态学方面的显著性差异。两 组小鼠基础水平的血流动力学指标也无明显差异(P0.05)。而LPS注射 后6小时,C3H月注eN小鼠左室最大收缩压明显降低,与注射生理盐水的 C3H/HeN小鼠和注射LPS的C3H/HeJ小鼠相比,差异具有统计学意义 (P0.05)。dP/dt脚ax和一dP/dt用ax也显著降低(P0 .05)。上述指标在注射 生理盐水的C3H用eN小鼠和注射LPS的C3H/HeJ小鼠之间无统计学差 异。 结论1、TLR4在小鼠心肌细胞上表达,LPS可以上调TLR4 mRNA和蛋 白的表达。2、LPS可以诱导小鼠心肌细胞合成TNF一a和IL一lp,它们构 成了全身炎症反应的一部分。3、LPS刺激下,TLR4野生型小鼠心肌 TNF一a和IL一lp的表达,而TLR4突变型小鼠未出现炎症反应,表明TLR4 在此过程中起着重要作用。4、TLR4介导了LPS诱导的小鼠左心室功能 的降低。本研究结果提示阻断TLR4的作用可能对有效预防或逆转LPS 诱导的心功能损害具有重要意义。


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