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密度感知信号系统在铜绿假单胞菌致大鼠肺部感染中的作用

王炜芳  
【摘要】:【目的】 研究密度感知信号系统在铜绿假单胞菌致大鼠肺部感染中的作用,并进一步明确密度感知信号系统对铜绿假单孢菌致病因子表达的调控作用,探讨其可能的作用机制。 【方法】 (1) 应用锐孔喷射装置,将两株铜绿假单孢菌的藻酸盐混悬液制成铜绿假单孢菌藻酸盐包裹体凝胶小珠,接种至大鼠肺部,建立两组大鼠慢性肺部感染模型,以无菌藻酸盐接种组作为空白对照组。(2) 在成功建立大鼠慢性肺部感染模型的基础上,通过对比研究的方法,比较野生型铜绿假单孢菌PAO1及密度感知信号系统基因缺失的铜绿假单孢菌变异株PAO1-JP2(LasR-LasI和RhlR-RhlI同时缺失,不表达N-乙酰基同型丝氨酸内酯)在大鼠呼吸道感染模型中细菌学指标、病理学指标、免疫学指标的不同,从而评价两株菌在大鼠呼吸道感染中的致病差异性。应用血液涂片染色方法计数两组外周血白细胞分类百分比;分别应用大体病理学、显微组织病理学分级评分的方法评价两组肺炎模型的肺部病理变化程度;应用菌落计数法测定两组肺部感染存活菌数;应用ELISA法测定血清中抗铜绿假单胞菌抗体效价及肺组织匀浆中细胞因子干扰素-gamma(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4);应用免疫组织化学方法测定肺组织中IL-4含量。(3) 体外检测毒性因子:应用弹性蛋白酶-刚果红的方法,测定比较两株细菌弹性蛋白酶活性;应用Western blotting的方法,比较两株菌外毒素A的含量差异。 【结果】 (1) 慢性肺部感染模型建立:感染后3、7、14、28天,肺组织匀浆菌落计数显示,对照组肺组织均未培养出细菌,PAO1组和PAO-JP2组肺组织均分别培养出野生型和变异型铜绿假单孢菌,菌落计数均>10~3CFU/g。病理 密度感知信号系统在铜绿假单抱菌致大鼠慢性肺部感染中的作用 中文摘要 学指标显示:感染后3、7天,感染动物肺组织均有不同程度的脓肿、实变、 水肿、不张、出血表现,镜下可见中性粒细胞聚集在藻酸盐包被体周围,形 成脓肿。感染后14、28天,实变逐渐减少,以局部肺不张、纤维增生、肉芽 肿形成为主要表现。(2)两组慢性肺部感染模型的差异性比较:①感染学方 面,PAOI一JPZ感染组大鼠死亡率(1 0.59%)明显低PAOI感染组(29.8%)。 在感染早期嵘3天),两组模型在细菌学指标(logl0CFU/g)、病理学指标方 面均未见显著性差异。在感染的中后期(第7一28天),PAOI一JPZ感染组病理 学指数评分、细菌学指标(1091。CFUlg)均显著低于PAOI感染组。②免疫学 指标方面,与PAO一JPZ组相比,在感染早期(第3天),PAOI组『N一Y明 显升高,而中性粒白细胞(PMN)百分比、C反应蛋白(CRP)则显著较低; 在感染的中期(第7天),PAol组PMN百分比、cRP,『N一Y、IL一4均显 著升高,感染的后期(第14一28天),PAol组『N一Y、IgGZa持续降低,IL一4、 IgG、IgGI则持续升高。(3)体外试验结果:①弹性蛋白酶活性:PAol弹 性蛋白酶活性显著高于PAO一JPZ,PAO一JPZ弹性蛋白酶的活性接近于0。②外 毒素A含量:免疫印迹试验可见硝酸纤维素膜上PAol株在分子量73,加obp 处显示棕色条带,而PAO一JPZ株未见棕色条带。 【结论】(1)应用锐孔喷射装置,将铜绿假单抱菌/藻酸盐混悬液制成铜绿假 单抱菌藻酸盐包裹体凝胶小珠,接种至大鼠肺部,可以成功地建立大鼠慢性 肺部感染模型。(2)与野生型铜绿假单抱菌感染组相比,PAOI一JPZ感染组 大鼠表现出明显降低的死亡率,明显增快的病理指数改善率,显著升高的肺 部细菌清除率和显著增快的肺部细菌清除速度。因此,具有密度感知信号系 统的野生型铜绿假单抱菌引起的肺部感染较为严重。而两组免疫学指标方面 的差异,则显示了两株菌在免疫反应过程方面有所不同,这可能是PAOI组 感染持续存在的原因之一。(3)体外测定显示,PA01株存在弹性蛋白酶活性、 外毒素A含量的表达,而PA01一JPZ株则表现出弹性蛋白酶活性、外毒素A 解放军军医进修学院博士学位论文 密度感知信号系统在铜绿假单抱菌致大鼠慢性肺部感染中的作用 中文摘要 表达的完全缺失。(4)结合体内外实验结果,本研究显示:密度感知信号系 统通过控制铜绿假单抱菌细胞外重要毒性因子,如弹性蛋白酶活性、外毒素 A等的表达,在铜绿假单抱菌致病作用中扮演重要的角色。


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