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人体皮肤上皮细胞异常增殖和分化特征及其与创(烧)伤不同修复结局关系的研究

姜笃银  
【摘要】:人体皮肤上皮细胞异常增殖和分化特征及其与创(烧)伤不同修复结局关系的研究 【目的】皮肤创(烧)伤后创面自然愈合会产生不同的修复结局,包括正常瘢痕、增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)、瘢痕疙瘩(keloid,Ke)、慢性溃疡和假性上皮瘤样增生(pseudoepitheliomatous hyperplasia,PEH)病变等。这些病理性结局的产生固然与自身免疫状态、局部损伤深度、感染和炎症反应等综合因素有关,但作为深度损伤的修复主体-皮肤附件(SAs)与表皮(干)细胞对创面再上皮化和病变形成发挥至关重要的作用。因此,本研究将从胚胎表皮和附件形态发生、深Ⅱ度烧伤创面汗腺上皮细胞复层上皮化,以及HS、Ke和PEH形成过程中表皮和皮肤附件(SAs)变化等方面入手,探讨生理和病理条件下上皮细胞增殖和分化(转分化)对组织发生和不同修复结局的影响,为认识创伤修复规律和提高创面愈合质量提供理论依据。 【方法】收集不同时间点人胎儿、成人正常皮肤(NS)标本、皮肤深Ⅱ度(DBW)和浅Ⅱ度烧伤创面(SBW)标本以及不同愈合结局(HS、Ke和PEH)组织标本,在组织形态学观察的基础上,采用免疫组化和免疫荧光(双)标记、mRNA原位杂交、流式细胞分析和计算机辅助图象扫描分析技术等,调查人胚胎发育阶段表皮细胞及其SAs形态发生、临床DBW汗腺复层上皮化以及病理性愈合结局SAs破坏过程中,上皮细胞组织表型与分化表型之间的关系。具体包括:(1)不同角蛋白分子表达与上皮增殖和分化的关系,如增殖性蛋白标记-细胞角蛋白(CK)56、CK14和CK17,(胚胎)表皮干细胞标记-CK818和CK19,以及终末分化标记-CK10,腺上皮细胞功能性标记-分泌成分(SC)等;(2)上皮细胞表达金属蛋白酶(MMP-2,-3,-9)和金属蛋白酶抑制物(TIMP-1,-2)对Ⅳ型胶原(ColIV)、层粘连蛋白(laminin,LN)基底膜结构成分形成的影响:(3)细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、上皮细胞钙粘附蛋白(E-cadherin,E-Cad)和β-链蛋白(β-catenin,β-Cat)表达水平,对上皮细胞异常分化和迁移的影响;(4)组织中干细胞因子(stem cell factor,SCF)及其受体 博士后名丹究工作J晨告 (c一Kit/CDx17)和白介素门L)一6等表达水平对分化杭原簇一14(cluste:of difterentiation,eol4)、en6s和肥大细胞类胰蛋白酶(l刀ast eell tryptase,MCT) 阳性细胞分布、细胞生长和分化的诱导作用;(5)上皮细胞表达广谱CK〔cKp)、 转化生长因子一田(TGF一pl)及其受体TGFpRI表达水平与波形蛋白(vim)和a一sMA 表达之间的关系,探讨 TGF一印/TG FpRI信号系统对成体上皮一间质细胞转化 ‘巨州~二一epithelia卜mesenellylllal trans、,·:二ati。。, EMT)和胚胎间质一上皮细胞转化(mesenchyma一epstllelia一transfor,nation,MET) 的诱导作用及其生物学意义;(6)细胞增殖性核抗原(PcNA)和凋亡相关蛋白分子 (Bcl一2和Bax)表达水平与表皮、皮肤附件上皮细胞增殖和分化以及结构异常的 关系;(7)成纤维细胞生长因子(FGF) 10(KGFZ)及其受体(FGFRZb/Bek)信号 系统对胚胎表皮细胞增殖、分化和皮肤附件发生的诱导作用。 此外,在建立新生大鼠表皮角肮细胞分离、培养和纯化方法和技术的基础上, 对培养第3一5代角阮细胞采用重组人TGF一p】(rh TGF一日!)和/或重组人表皮生长因 子(rhEGF)进行离体刺激实验,并对Dispase和胰蛋白酶分离的早期人增生性疲 痕表皮细胞,采用进行免疫组化、免疫荧光和流式细胞分析等方法动态观察EMT 的组织表型和分子表型的改变。 具体分以下五个部分进行总结: 1.胚胎期表皮细胞及其皮肤附件发生 【结果】在人胚胎胎龄(EAG)6一sw期间,外胚层细胞Vi:n+一a一sMA一向cKS!8十- CK19十表皮干细胞转变,并检测到中等强度(+十)TGF口R工信号,但TGF口!信 号十分微弱;至EA GI ow以后呈现表皮细胞典型的组织形态学特征。在EAG 1 lw, 表皮细胞开始表达CK一9和eKS6,在表皮下过度表达FGF一。、PCNA和 Bel·2的 间质细胞开始成团聚集;在EAG I3w时,分层的表皮细胞浅层出现CKIO,周皮细 胞开始脱落;在基底层细胞CK14、PcNA、Bek和p一Cat信号明显增强的区域,细 胞局灶性增殖形成毛囊原基(胚芽),在其向真皮内侵入生长的同时,上皮细胞 E一cad表达水平与周围间质细胞表达FGF10呈现相反的表达趋势:在EAG16w皮 脂腺发生的同时,表皮一真皮依次重复上述信号并开始汗腺形态发生。 [结论l(1) EAG6一sw是人胚胎皮肤表皮细胞经由MET发生的重要时期,TGF 博士后对究互‘乍报告 .‘亩亩‘菌‘‘亩亩.亩‘亩‘‘‘亩‘亩亩‘亩‘‘.‘亩亩‘‘亩‘‘亩‘亩~‘ 口RI信号通路可能参与了MET调变过程,但其配体一TGF日】起源及其作用机制有 待研究。(2)间质细胞源性FGF10以旁分泌方式作用于上皮细胞Bek,并通过合 理调配p一cat和E一cad信号,诱导表皮干细胞增殖分化和SAs形态发生· 2.汗睐上皮细胳表皮细胞转化机制与DBW愈合的关系 l结果1 NS汗腺分泌部基底层的肌上皮细胞表达卜Cat、Bcl一2、CK19、P63和 eK14:浅51度烧伤创面(superfieial 110 bLlrn wounds,sBW)愈合期间深层汗腺分 泌部与NS组相似。在深11度烧伤创面(deep 110 bL!rn woL一


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