中药通过激活PPARs治疗糖尿病胰岛素抵抗机制的研究及新型胰岛素增敏剂的筛选

【摘要】：目的 进行PPARγ、PPARα、PPRE表达载体的构建、扩增与提取,组建具有较高灵敏性的PPRE荧光素酶筛选系统。方法 用RT-PCR方法扩增小鼠PPARγ和PPARα DNA片段,重组到pCMX表达质粒,将合成的PPRE DNA亚克隆到pGL3荧光素酶表达质粒,提取质粒DNA。应用脂质体(SuperFect)将pGL3-CMV、PPARγ和PPRE与pRL转染COS-7细胞和HepG2细胞,24h后分别加入pGL3-CMV及不同剂量的吡格列酮(PGZ),继续孵育24h,应用双报告荧光素酶基因检测系统检测荧光素酶活性。结果 (1)提取后的PPARγ、PPARα及PPRE表达载体,经测序证实无突变插入方向正确,表达载体以环状DNA为主。(2)pGL3-CMV明显增强荧光素酶活性为对照组的14.9倍(P0.01),PGZ呈剂量依存性地增强PPARγ活性,PGZ 10~(-5)达到最高值为对照组的6.1倍(P0.01);(3)PGZ10~(-6)、10~(-5)增强HepG2细胞荧光素酶活性分别为对照组的3.6(P0.01)、5.4倍(P0.01)。结论 成功地进行了PPARγ、PPARα、PPRE质粒的构建、扩增与提取,组建了具有较高敏感性的PPARs表达筛选系统。