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腺相关病毒介导肌浆网钙ATP酶基因治疗慢性心力衰竭犬的实验研究

付治卿  
【摘要】: 心力衰竭是各种心脏病的终末阶段,其发病率、死亡率高,被称为心脏病最后的大战场。长期以来心力衰竭的治疗一直是从增加心肌收缩力和减轻心肌负荷着手。尽管近年来心衰治疗取得了很大的进步,但疗效仍有限,心衰的死亡率仍然相当高。随着分子生物学的飞速发展,基因治疗作为一种新的治疗策略为慢性心衰的治疗提供了新的途径。研究发现,Ca~(2-)调节的改变是各种病因心力衰竭发展的必然通路。在参与Ca~(2+)循环的各种Ca~(2-)调节蛋白中,心肌肌浆网Ca~(2+)ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca~(2+)-ATPase,SERCA2a)的蛋白水平和活化程度是细胞内Ca~(2+)稳态的决定性因素。心力衰竭时SERCA2a活性下降,导致心功能恶化。已有多项研究在细胞和小动物水平证实,通过基因转导的方法增加SERCA2a的表达能够改善衰竭心肌的收缩和舒张功能。本研究以重组腺相关病毒1(rAAV2/1)为载体在犬体内评价SERCA2a转基因治疗大动物心衰的疗效和安全性;并进一步探讨SERCA2a基因转导治疗心力衰竭的可能机制。为SERCA2a基因治疗迈向临床奠定大动物水平的实验基础。 首先,通过右心室快速起搏成功构建了慢性心力衰竭犬模型。并发现超声心动图测定的犬LV EF和FS与血流动力学检测到的+dP/dt_(max)呈良好的正相关(P<0.01),证实了超声心动图是动态评价心脏结构和功能转变的良好的无创手段。 其次,将实验犬分为4组:对照组、HF组、HF+EGFP组和HF+SERCA2a组;HF+SERCA2a组又分为转导30天和转导60天两个亚组(HF+SERCA2a 1组和HF+SERCA2a 2组)。通过开胸心肌内直接注射的方法,将rAAV2/1-EGFP和rAAV2/1-SERCA2a分别导入HF+EGFP组和HF+SERCA2a组犬体内。SERCA2a导入30天时,犬食欲明显好转,活动显著增加;EF、FS较HF组、HF+EGFP组显著好转(P<0.01);LVSP、+dP/dt_(max)和-dP/dt_(max)明显升高,平均值较HF+EGFP组分别增加54.12%、146.81%和71.52%,LVEDP则降低了63.43%,所有参数与对照组相比无显著差异。但导入60天组食欲、活动量却再次下降,心肌收缩和舒张功能指标也显著恶化,与对照组相比有显著性差异。 随后,以PCR方法从DNA水平检测了rAAV2/1-SERCA2a转导后在犬体内的分布。发现除注射AAV的心肌区域外,未注射AAV的心肌区域、主要脏器和骨骼肌、性腺中均未检测到含rAAV_(2/1)-CMV-SERCA2a核苷酸序列的DNA片断。由于存在内源性SERCA2a的表达,进一步以RT-PCR和Western blot从RNA和蛋白水平分析。结果显示,对照组SERCA2a主要表达于心肌、慢收缩肌(腰大肌、咀嚼肌)和睾丸中;SERCA2a转导组也表现为相同的表达谱,未在其他组织中检测到SERCA2a的表达,表明rAAV_(2/1)介导的基因转导是相对安全的,未整合到心脏以外的其他组织。以双夹心ELISA法检测了转导组犬的血清,未检测到抗rAAV_(2/1)的抗体,提示rAAV_(2/1)转染未在犬体内引发体液免疫。另外,SERCA2a转导组心肌氧耗、心律失常发生率并未增加;反映心肌损伤的生化标记物CK-MB、cTnT较HF犬降低,与对照组相比无显著差异。同时,代表机体炎症反应的CRP、IL-6在SERCA2a转导后未发生显著增加;肝肾功能也无损伤。 最后,我们应用蛋白质组技术分析了SERCA2a基因转导对心力衰竭犬心肌组织蛋白质组的影响。对其中10个表达明显改变的蛋白点进行质谱分析,经鉴定分别是与心肌收缩相关的肌球蛋白轻链1心房亚型、慢收缩骨骼肌TnT和心肌TnT;与能量代谢相关的NADH脱氢酶1α亚基,及应激相关蛋白-结合珠蛋白重链、热休克蛋白B6和半乳凝素1。另外,还检出一种未命名蛋白CG30493-PB isoform 1,它在SERCA2a转导后显著上调。根据这些蛋白表达的变化,推测SERCA2a基因转导主要通过以下机制改善心功能:①恢复心肌收缩相关蛋白正常表型或正常表达量;②增加心肌能量产生;③改变应激相关蛋白的表达。 综上所述,我们在大动物体内证实了rAAV2/1载体介导SERCA2a基因转导可在一定时期内改善衰竭心脏的收缩和舒张功能;未发现载体在心外其他组织表达,也未发生明显的全身炎症反应和肝肾功能的损伤;同时并不增加细胞内cAMP和Ca~(2+)浓度,心律失常的发生率和心肌氧耗也未增加,是一种安全有效的治疗手段。


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