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RNAⅢ抑制肽防治骨科内植物葡萄球菌感染的实验研究

邢庆昌  
【摘要】: 目的 采用有机化学固相合成Fmoc法合成高纯度RNAⅢ抑制肽(RNAⅢ-inhibiting peptide,RIP);体外、体内实验验证RIP抑制葡萄球菌感染和生物被膜形成的能力;体外实验研究RIP抑制葡萄球菌在骨科内植物表面粘附及形成生物被膜的能力;体内动物实验验证RIP治疗骨科内植物(人工关节假体)葡萄球菌感染的可行性。 方法 1、RIP的合成、提纯与鉴定:根据已知的氧基酸序列,采用固相合成Fmoc法合成RIP粗品,利用反相高效液相色谱法对RIP粗品进行纯化,对纯化后的RIP肽进行质谱分析、氨基酸组成分析、氨基酸序列分析、红外光谱分析及蛋白活性鉴定。 2、体外、体内验证RIP防治葡萄球菌感染和抑制生物被膜形成的效果:RIP在体外对金葡菌毒素(肠毒素和溶血素)产生的影响;应用荧光显微镜观察RIP体外对表皮葡萄球菌在Hela细胞表面粘附能力的影响;将RIP与表皮葡萄球菌ATCC12228和ATCC35984菌株共同培养,观测RIP对表皮葡萄球菌胞外粘质物(ESS)产生的影响;通过RIP与抗生素联合用药后生物被膜内活菌计数的比较研究RIP与抗生素之间的协同作用。建立大鼠皮下囊内植物金黄色葡菌感染模型,植入分别经生理盐水、10mg/mlRIP、30mg/ml左氧氟沙星及混合药液浸泡20分钟的涤纶材料,缝合后向囊内注入0.5ml浓度为2×10~7cfu/ml的金葡菌RN6390B,术后观察各组大鼠生命体征变化和不同时间点的存活率,并进行涤纶材料表面生物被膜内活菌计数。 3、RIP防治骨科内植物材料葡萄球菌感染和生物被膜形成的体外实验研究:将细菌ATCC35984用FITC标记后与骨科常用生物材料:钛合金、钴铬钼合金、高分子聚乙烯(每种材料有光滑和粗糙两种不同的表面)共同培养,荧光显微镜观察细菌对不同材料表面的粘附情况及RIP对细菌粘附能力的影响;应用扫描电镜(SEM)和激光共聚焦显微镜(CLSM)观察RIP体外对骨科内植物材料表面表皮葡萄球菌生物被膜形态学的影响;最后,通过SYT09(活菌)和PI(死菌)双染色,对RIP的作用机理进行初步探讨。 4、RIP防治家兔人工膝关节置换假体葡萄球菌感染的实验研究:以家兔为对象建立全新的人工膝关节置换模型,向术后关节内接种表皮葡萄球菌ATCC35984,并同时注入RIP或抗生素,制造关节假体感染模型,以术后动物全身情况、体温体重变化、WBC、CRP、血清铜锌比、关节感染程度、假体表面生物被膜细菌计数为观测指标,从多个角度观察RIP对关节假体葡萄球菌感染的防治效果。 结果 1、RIP的合成、提纯和鉴定:采用固相合成Fmoc法可以合成得到稳定的RIP肽,经反相高效液相色谱法纯化可得到纯度为97.42%的多肽,质谱分析显示合成多肽的分子量为914.37,与RIP理论上的分子量基本一致的;氨基酸组成分析显示RIP由表酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)、脯氨酸(P)、色氨酸(W)、苏氨酸(T)、门冬酰胺/氨酸(N)和苯丙氨酸(F)七种氨基酸组成,其比例依次为0.995:0.950:0.996:0.382(酸水解破坏):0.987:1.019:1.00;氨基酸序列分析显示上述氨基酸的排列顺序为YS-P-W-T-N-F,与RIP的分子式完全吻合;傅立叶红外光谱分析检测到NH键和CN键的伸缩震荡,该蛋白含有与RAP共有的-NH_2末端结构;蛋白活性分析显示RIP可以有效抑制菌液中RNAⅢ的产生,具有很强的生物活性。 2、RIP在体外、体内均可有效防治葡萄球菌感染和抑制生物被膜形成:RIP在体外可有效抑制金葡菌肠毒素B和溶血素的产生;RIP体外可以明显减少表皮葡萄球菌对Hela细胞的粘附;RIP可减少葡萄球菌生物被膜形成过程中胞外粘质物(ESS)的分泌;RIP与左氧氟沙星联用具有协同作用;RIP与左氧氟沙星联用可有效防治大鼠皮下囊涤纶内植物葡萄球菌感染。 3、RIP在体外可有效防治骨科内植物材料葡萄球菌感染和生物被膜形成:表皮葡萄球菌对不同骨科生物材料的粘附能力存在差别:粗糙超高分子聚乙烯>光滑超高分子聚乙烯>粗糙钴铬钼合金>粗糙钛合金>光滑钴铬钼合金>光滑钛合金;RIP可有效减少表皮葡萄球菌在上述材料表面的粘附和生物被膜形成;荧光双染色实验结果显示RIP本身没有明显的杀菌作用,但对抗生素有明显的增效协同作用。 4、RIP防治骨科人工膝关节置换模型假体葡萄球菌感染的实验研究:RIP与抗生素联用组体温、体重变化、WBC及CRP水平、关节炎症程度均优于其余各组,单用RIP的效果与左氧氟沙星相当,两者联合应用可有效防治骨科关节假体葡萄球菌感染。 结论 1、我们在国内首次通过固相合成Fmoc法和反相高效液相色谱法合成得到高纯的RIP肽,合成得到的RIP具有与天然RIP相同的结构和功效。 2、在体外,RIP可以有效抑制金葡菌毒素的产生,减少表皮葡萄球菌对骨科生物材料及Hela细胞表面的粘附,减少ESS的产生,抑制葡萄球菌在骨科内植物材料表面形成生物被膜。 3、在体内,RIP可以有效防治内植物,尤其是人工关节假体,发生的葡萄球菌感染,抑制内植物/假体表面生物被膜的形成。 4、RIP通过干预葡萄球菌QS系统的信号传导而抑制葡萄球菌感染和生物被膜形成,为细菌感染的防治开创了一条全新的思路。


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