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人牙龈成纤维细胞对口腔常用抗生素的跨膜转运

冷斌  
【摘要】: 多项研究表明,牙周致病菌可侵入牙龈上皮细胞和成纤维细胞内,并逃避宿主的防御机制,这种细胞内感染成为牙周病发生、发展、复发的关键因素。多种抗生素在龈沟液、牙龈组织中的浓度要显著高于血药浓度,其机理可能是牙周组织细胞可以转运药物至细胞内。人工种植体给药系统以及牙根管给药系统的理论基础之一是牙周组织细胞具有转运药物的能力。为了探讨牙周局部给药及两种给药系统设计的可行性,本课题研究人牙龈成纤维细胞对7种口腔常用抗生素的跨膜转运。全文分两大部分。 第一部分实验人牙龈成纤维细胞原代培养方法的比较研究 目的:建立和评价人牙龈成纤维细胞原代培养方法,并观察其生物学特性。材料与方法:分别用组织块法、两种改良酶消组织块法培养人牙龈成纤维细胞(HGF),用形态学、免疫荧光法鉴定细胞来源。通过活细胞观察,MTT比色实验研究细胞体外生长特性。比较三种培养方法培养HGF的效果。结果:获得的细胞呈梭形,抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性,符合人牙龈成纤维细胞的形态学特征和生物学特性。组织块法、改良酶消组织块法(翻瓶法)、改良酶消组织块法(盖玻片法)的细胞培养成功率分别为26.7%,54%,60%(P<0.01)。组织块法和两种改良酶消组织块法间的成功率差异有显著性(P<0.01),两种改良酶消组织块法间的成功率差异无显著性(P>0.05)。结论:本实验建立的细胞系为人牙龈成纤维细胞。两种改良酶消化组织块法可显著提高人牙龈成纤维细胞原代培养成功率。 第二部分实验人牙龈成纤维细胞对口腔常用抗生素的跨膜转运 目的:研究人牙龈成纤维细胞对7种口腔科常用抗生素(甲硝唑,替硝唑,盐酸四环素,盐酸米诺环素,头孢噻肟钠,诺氟沙星,左氧氟沙星)的跨膜转运,初步探讨药物浓度和药物孵育时间对药物转运量的影响,为牙周局部给药、人工种植体给药系统以及牙根管给药系统设计的可行性提 供实验依据。材料与方法:1将人牙龈成纤维细胞与含有药物(药物:甲硝唑,替硝唑,盐酸四环素,盐酸米诺环素,头孢噻肟钠,诺氟沙星,左氧氟沙星。药物浓度:10ug/ml,20ug/ml,40ug/ml,100ug/ml)的磷酸盐缓冲液(PBS)共同孵育1,5,10,15(min)后,收集各时间点细胞,超声波破碎细胞。用高效液相色谱法测定裂解液中的药物含量,用考马斯亮蓝法测定细胞蛋白总量。用细胞内药物含量与细胞蛋白的比值作为观察药物转运量的检测指标。2用激光共聚焦显微镜观察人牙龈成维细胞转运盐酸四环素和盐酸米诺环素的过程。结果:1在接近药物转运稳定状态时(药物浓度40ug/ml,孵育时间10min),细胞内药物含量分别是1.340±0.288ng/μg(甲硝唑),2.071±1.028ng/μg(替硝唑),2.117±0.272ng/μg(盐酸四环素),7.039±0.937ng/μg(盐酸米诺环素),0.570±0.042ng/μg(头孢噻肟钠),1.172±0.391ng/μg(诺氟沙星),1.448±0.178ng/μg(左氧氟沙星)。转运能力的排序为:盐酸米诺环素>盐酸四环素>替硝唑>左氧氟沙星>甲硝唑>诺氟沙星>头孢噻肟钠。盐酸米诺环素的转运量约为盐酸四环素的3.32倍,替硝唑的3.40倍,左氧氟沙星的4.86倍,甲硝唑的5.25倍,诺氟沙星的6.01倍,头孢噻肟钠的12.35倍。2不同药物浓度和孵育时间下药物的转运量有显著性差异(P<0.01)。3不同药物转运达到稳定状态的时间不同(P<0.01),多数药物在10min,15min接近转运稳定状态。甲硝唑、替硝唑5min就接近转运稳定状态。4随着药物浓度升高和药物孵育时间变长,细胞内盐酸四环素和盐酸米诺环素荧光增强,盐酸四环素和盐酸米诺环素在被转运的早期(15min内)仅分布在细胞质中。结论:1人牙龈成纤维细胞可以跨膜转运这7种抗生素进入细胞内,转运量的大小有差异。2细胞内药物的转运量呈现药物孵育浓度依赖性和时间依赖性。3高效液相色谱法测量稳定、分离度好、灵敏度、准确度、精密度高,可以用于细胞内上述药物含量的检测。4激光共聚焦显微镜可动态监测活细胞转运具有荧光性的药物。


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