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烧伤大鼠骨髓间充质干细胞迁移到外周血的相关机制研究

韩冰  
【摘要】: 目的:1.从烧伤大鼠外周血和大鼠骨髓内分离培养间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),并比较不同来源的MSCs的生物学特性。2.研究烧伤大鼠血清和肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor-a,TNF-a)、粒细胞-集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF)对MSCs表达细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(vescular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)的影响;观察烧伤大鼠血清、TNF-a和G-CSF对MSCs的迁移能力和黏附功能的影响。3.研究JAK-STAT、MAPK和NF-κB信号通路在TNF-a诱导的MSCs迁移能力改变中的作用。 方法:1.从正常大鼠和烧伤大鼠骨髓和外周血分离培养MSCs,用免疫细胞化学、Western blotting法对分离培养的MSCs进行鉴定,观察并比较各组MSCs的增殖情况和生物学特性;2.用免疫细胞化学、Western blotting和RT-PCR的方法检测烧伤大鼠血清、TNF-a和G-CSF对MSCs表达ICAM-1和VCAM-1的影响,用transwell小室检测烧伤大鼠血清、TNF-a和G-CSF对MSCs的趋化作用,用Matrigel胶黏附法检测上述因素对MSCs黏附功能的影响,并用抗体中和实验确证TNF-a和G-CSF的作用;3.用凝胶电泳迁移率改变分析试验检测TNF-a处理后MSCs细胞内NF-κB的活化,用Westernblotting的方法检测TNF-a处理后MSCs内JAK-STAT和MAPK信号通路相关蛋白的表达情况,并用ERK蛋白阻断剂PD98059或p38蛋白阻断剂SB203580对相关信号通路进行阻断后观察TNF-a对MSCs表达ICAM-1及其迁移能力的影响。 结果:1.从部分烧伤大鼠外周血标本内(7/12)能分离培养到MSCs,而从正常大鼠外周血内未培养出MSCs。不同来源的MSCs的形态和表型无明显差异。各组细胞的生长曲线相似,但烧伤大鼠外周血来源的MSCs的克隆形成能力比骨髓来源的MSCs弱。2.烧伤大鼠血清和一定浓度的TNF-a能上调MSCs表达ICAM-1,但不影响MSCs表达VCAM-1。G-CSF处理不影响MSCs表达ICAM-1和VCAM-1。烧伤大鼠血清和一定浓度的TNF-a能增强MSCs的迁移能力和黏附功能。一定浓度的G-CSF能影响MSCs的黏附功能,但不影响MSCs的迁移能力。抗体中和实验结果发现,TNF-a和G-CSF对MSCs的相关效应可以被中和抗体完全抑制。3.一定浓度的TNF-a处理后,MSCs内磷酸化ERK蛋白和磷酸化p38蛋白表达增加,p38阻断剂SB203580能明显抑制TNF-a诱导的MSCs表达lCAM-1的改变,也能部分抑制TNF-a对MSCs的趋化效应。ERK阻断剂PD98059不能阻断TNF-a诱导的MSCs表达ICAM-1的改变或TNF-a对MSCs的趋化效应。 结论:1.烧伤后,大鼠骨髓内的MSCs可以迁移到外周血。2.烧伤大鼠血清或TNF-a处理能使MSCs表达ICAM-1增加,同时能促进MSCs的迁移和黏附功能。3.TNF-a促进MSCs迁移与MSCs表达ICAM-1增多有关。4.TNF-a促进MSCs迁移的过程,与p38信号通路的活化有关。5.本研究初步阐明了烧伤大鼠骨髓MSCs迁移到外周血的机制,为临床利用自体干细胞进行创伤修复提供了实验基础。


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