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犬骨髓单个核细胞移植对梗死后心室重构的抑制作用及相关基因变化

任崇雷  
【摘要】: 目的: 1.研究骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNCs)的体外分离、标记及鉴定方法。 2.建立犬急性心肌梗死模型并观察梗死后心室重构的变化。 3.研究BMMNCs移植后梗死心脏形态、结构及功能的变化。 4.研究BMMNCs移植后梗死心脏胶原及基质金属蛋白酶等相关分子基因的变化,探讨细胞移植影响梗死后心室重构的分子机制。 方法: 1.应用Ficoll法分离BMMNCs,台盼蓝染色检测其活性,瑞氏染色行形态学观察,用DAPI标记行荧光观察,用流式细胞仪检测CD34阳性细胞的含量,细胞培养传代观察。 2.采用改良开胸冠脉结扎法建立犬急性心肌梗死模型,用超声心动图(UCG)连续观察心脏形态及功能变化,心肌核素扫描观察心肌灌注,6周后处死行心脏大体形态及组织病理学观察。 3.成年犬24只随机分4组:急性心梗对照组及移植组(心梗后1h),陈旧心梗对照组及移植组(心梗后4w)。心肌直接注射法行自体BMMNCs移植,UCG观察心脏形态及功能变化,行心脏大体形态、荧光及组织病理学观察。 4.BMMNCs移植后取心肌标本,用羟脯氨酸法检测心肌中胶原含量,用RT-PCR方法检测心肌中Ⅰ和Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶2和9(MMP-2、-9)、基质金属蛋白酶抑制因子1和2(TIMP-1、-2)、转化生长因子β1(TGF-β1)及血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA表达;心肌组织中抽提核蛋白用Western Blot方法检测NF-κB的表达。 结果: 1.用Ficoll分离法可分离得到5~12×10~7个BMMNCs,台盼蓝染色拒染率95%,形态为均一大小的单个核细胞,DAPI荧光标记率95%以上,流式细胞仪检测CD34+细胞占1.8±0.28%;细胞培养后1周形成克隆性集落。 2.犬心梗模型早期均表现出典型的心肌缺血改变,后期行UCG、核素扫描及大体、组织病理观察均见明显的心肌梗死区,室壁瘤发生率69.2%,模型成功率92.8%;UCG还显示心梗后左室内径及容积逐渐扩大,室间隔及左室后壁逐渐增厚。 3.BMMNCs移植后UCG检查表明,左室舒张末径及容积、室间隔及左室后壁厚度均降低;陈旧心梗期细胞移植后EF值及FS值升高。大体形态学观察可见细胞移植后梗死区厚度增加,而梗死区长径减小;急性心梗移植后无室壁瘤发生,而陈旧心梗移植组长轴短轴之比增加。细胞移植后在移植细胞区均观察到荧光表达,但多数核形态不规则,未观察到发荧光的成熟心肌细胞核形态。组织学观察见细胞移植后有较多新生毛细血管生成,急性心梗移植组还伴有较多淋巴细胞浸润。 4.BMMNCs移植后心肌胶原含量减少。RT-PCR检测发现细胞移植后以Ⅰ型胶原mRNA降低为主;同时心梗区及心梗周围区MMP-2、-9及TGF-β_1 mRNA亦降低,而TIMP-1、-2 mRNA增高;急性心梗期细胞移植后VEGFmRNA水平普遍升高,而陈旧心梗移植后仅在心梗周围区表现出升高;westernblot检测发现BMMNCs移植后心梗区及心梗周围区NF-κB水平均降低。 结论 1.用Ficoll分离法可获得足够数量的犬BMMNCs,经DAPI荧光标记后亮度稳定;经鉴定含主要干细胞成分HSCs和MSCs,可作为供体细胞移植。 2.改良结扎法建立的犬心梗模型形成了透壁性心梗及室壁瘤样改变,具有典型的梗死后心室重构变化,为梗死后重构研究提供了可靠的动物模型。 3.BMMNCs移植在急性或陈旧心梗期均发挥了有益的作用,在形态和结构上抑制了心室重构的发展,同时促进了血管新生,从而改善了心功能。 4.BMMNCs移植抑制了心肌胶原的合成,相关基因MMPs、TGF-β_1,上调及TIMPs、VEGF上调及核蛋白NF-κB降低,这些变化共同参与了细胞移植对梗死后心室重构的抑制作用,且主要通过影响基质重构及血管重构起作用。


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