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颅脑创伤后脑红蛋白表达变化的研究

林欣  
【摘要】: 氧是生命活动之源,是人类及其他生物赖以生存的条件,氧代谢和氧利用也一直是生命科学研究中的重要命题。早期的研究发现血红蛋白(hemoglobin,HGB)和肌红蛋白(myoglobin,MGB)是机体实现氧的转运与储存、线粒体耗氧产能以及多余氧的清除等过程中的关键载体,在生命活动所需的氧代谢过程中发挥重要作用。众所周知,脑是机体耗氧量最大的器官,也是对缺氧最为敏感的器官。但是,长期以来,我们不知道在神经系统中是否也存在一种特异的携氧蛋白能够促进神经元的氧和能量代谢。直到2000年,Burmester等报道了一种具有高度氧亲和力,主要表达于脑组织中的脊椎动物单体球蛋白一脑红蛋白(neuroglobin,NGB)。其特异性地在脊椎动物大脑及视网膜神经元呈现高表达,提示它在中枢神经系统氧及能量的代谢活动中中可能起着极其重要的作用。目前体内和体外的实验研究均表明,缺氧可以诱导神经元NGB的表达升高,而且,高表达NGB有助于细胞耐受缺氧损伤,而抑制NGB的表达则会加重细胞的损伤;NGB转基因小鼠在缺血、缺氧损伤中其脑梗死、心肌梗死面积显著减少。这些研究均提示,NGB作为脑缺氧的内源性保护因子可能成为将来治疗脑缺血、缺氧性损伤的新靶点。 在现实生活中,头部遭受暴力击打、高处坠落和交通事故伤频频发生。在临床工作中,我们经常需要面对颅脑外伤的患者,尤其棘手的是重型颅脑创伤的伤员。由于其原发伤重,并可于伤后迅速出现继发弥漫性脑肿胀、弥漫性轴索损伤,病死、病残率极高。如何能够对此类患者实施早期干预、打断或延缓颅脑创伤继发损害的进程成为现今临床工作的重点和难点。NGB的发现,无疑为此方面的研究提供了新的着眼点。但目前关于颅脑创伤与NGB的研究,国内外尚未见报道。作为脑内氧及能量代谢的关键因子,深入研究NGB在颅脑创伤后脑内表达的动态变化,将为进一步探讨NGB的功能奠定基础,并可能为将来相关临床治疗提供依据和新思路。为此,我们围绕颅脑创伤后脑内NGB的表达变化情况进行了以下研究: 1、选择经典的Marmarou’s落体打击模型造成大鼠的重型弥漫性颅脑创伤,以其模拟现实生活中常见的头部暴力打击伤、高处坠落伤和交通事故伤。通过对模型动物(成年SD大鼠)进行伤后行为学观察及组织病理学研究两方面对致伤情况进行评价。结果表明:本组模型动物死亡率为37.04%,实验组大鼠致伤后临床、组织病理学变化均符合经典Marmarou's法所致重型弥漫性颅脑创伤改变。 2、采用SD大鼠作为研究对象,克隆了SD大鼠NGB基因编码序列(CDS),进而构建含有该编码序列的质粒。为本实验第三部分中实时定量PCR在核酸水平检测创伤后脑组织NGB的表达变化做准备,即构建目的基因的阳性质粒标准品;同时,为今后进一步构建NGB的表达质粒以进行真核转染做准备。亚克隆之质粒插入序列Blast分析表明,本实验克隆的NGB cDNA序列与大鼠NGB cDNA的编码序列(NM033359)比较一致性为98%。经测定该质粒浓度为260μg/ml,可作为阳性质粒标准品用于下一步实时定量PCR实验。同时,亦可用于将来NGB的真核表达载体构建。 3、通过制备大鼠颅脑创伤Marmarou's模型,研究了伤后脑内NGB在核酸及蛋白水平的动态变化规律。结果发现,创伤后脑组织中NGB表达在核酸、蛋白水平均呈“双峰”样变化。在颅脑创伤后的超早期(30min)出现NGBmRNA转录水平显著上调并达峰值;相应地,NGB蛋白表达亦于伤后1~2h增高,并于2h达峰值。此后,在创伤后急性期内NGB再次出现高表达(伤后12h的NGB mRNA转录水平升高,并于48h再次达高峰;NGB蛋白表达于伤后24~72h亦出现再次高表达,并于72h达峰值)。这说明创伤性应激及继发缺血、缺氧性损害能够诱导脑内NGB表达上调,提示NGB可能参与创伤应激及脑缺血缺氧损伤代偿,可能具有神经保护作用。 4、通过免疫组化研究颅脑创伤后脑内NGB表达的变化,及其与神经元凋亡之间的关系。结果表明,大鼠颅脑创伤后致伤区皮层神经元NGB表达呈现出“双峰”样变化趋势(分别于伤后2h、72h呈现出两次高峰表达);伤后30min~1h、48~72h期间大脑皮层区NGB表达的上调均伴随着Bax/Bcl-2比值上升趋势减缓甚至呈现下降趋势,提示NGB可能对神经元凋亡具有拮抗作用。


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