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脂肪及脂肪源性干细胞促进创面修复的基础研究

赵京禹  
【摘要】: 目的:研究脂肪源性干细胞的分离培养和鉴定以及细胞分化和其与脂肪组织对皮肤损伤的修复作用。 方法:(1)用0.1%Ⅰ型胶原酶消化大鼠脂肪,体外分离培养其中的脂肪源性干细胞(rADSCs),用免疫组织化学法和流式细胞术检测rADSCs的抗原表达及分化能力;体外模型采用皮肤匀浆液诱导rADSCs及ADSCs分别与热休克损伤的HEKa细胞共培养,诱导rADSC向表皮细胞定向分化,检测rADSCs的表型转化率。(2)rADSCs体外和体内促进创面修复的实验研究是通过:①刮擦生长融合成片的HEKa细胞,模拟制备皮肤创面的体外细胞模型,并加入rADSCs直接共培养,观察rADSCs对创面愈合的影响;②利用0.03%H_2O_2造成的HEKa创伤模型,加入rADSCs间接共培养,研究rADSCs向损伤部位迁移的特性;③在体外证实rADSCs促进创面修复的基础上,研究rADSCs向缺血部位的迁移和作为基因治疗的载体细胞的作用,用携带血管内皮生长因子(VEGF)基因的腺病毒(AdVEGF)感染rADSCs细胞,输注到已制备好皮瓣模型的SD大鼠体内,分别在输注后3d、7d后用相关软件分析成活皮瓣的面积,并用免疫组织化学法及流式细胞术检测皮瓣远端缺血部位中Brdu标记的rADSCS数量;④利用小香猪自体脂肪移植,观察脂肪组织对烧伤创面的治疗作用。 结果:(1)rADSCs表面表达CD49d、CD44、CD29、CD31、CD71、CD105抗原,不表达CD34,CD45和CD106等造血干细胞标志,以及CK19和CK14等上皮细胞标志,油红“O”染色证实rADSCs可向脂肪细胞分化;BrdU及Hochest33258均标记rADSCs的细胞核;(2)诱导rADSCs向表皮细胞表型分化:①皮肤匀浆液组成的条件培养基、EGF加入条件培养基、单纯EGF分别诱导rADSCs 3d后,CK19、CK14阳性率均较对照组明显升高(P<0.01=。诱导3d后rADSCs的细胞周期显示诱导后大部分rADSCs处于DNA合成和复制活跃的S期,提示皮肤匀浆液使rADSCs分裂增殖明显加快。②在热休克直接共同培养诱导试验中,CK14、CK19分别比直接共同培养(没有热休克)、间接热休克共培养、间接共培养中明显升高(P<0.01=。(3)①rADSCs促进体外HEKa细胞创面愈合实验中,实验组HEKa细胞迁移到创面细胞数量显著多于两个对照组(P<0.01),而两个对照组间无显著性差异(P>0.05),提示HEKa向创面移行作用与ADSC细胞的作用相关。脱氧胸腺嘧啶苷(thymidine)掺入培养基法表明rADSCs对体外共培养HEKa细胞的增殖作用显著大于阴性对照组和阳性对照组(P<0.01)。伤后创面愈合速率的结果显示:实验组较对照组均显著加快(P<0.01),而对照组间无显著性差异(P>0.05),提示ADSC可以通过加速HEKa增值和移行作用而参与创面修复。②HEKa损伤趋化rADSCs的迁移实验中,H_2O_2损伤组和擦伤50-60%融合细胞组,在致伤12小时后,向伤区移行的细胞数量分别为:8.2±0.15个/高倍视野和8.5±0.22个/高倍视野,而非致伤对照组向伤区移行的细胞数量为0。③在体rADSCs移植研究表明,实验组皮瓣的成活面积为59.6%,而腺病毒介导的VEGF_(165)基因过度表达,RT-PCR和细胞免疫荧光结果显示,Ad VEGF_(165)感染组rADSCs细胞自发分泌的VEGF较对照组提高约35%,表明过度表达VEGF_(165)基因能够明显增强rADSCs细胞的自分泌VEGF功能。④小香猪自体脂肪移植到自身Ⅲ度烧伤创面后7d发现创面愈合速率显著加快(P<0.01);脂肪治疗组的创腔容积显著减小(P<0.01)。免疫组化Ⅷ阳性染色结果显示脂肪治疗组比对照组血管密度大,提示创面愈合加快与新生血管较多有关。 结论:(1)CD49d可作为ADSCs的特异性标志,结合CD106、CD29、CD44等的表达可以把ADSCs与骨髓来源的干细胞区分开来。(2)在皮肤匀浆液组成的条件培养基诱导下,rADSCs可向表皮细胞分化,分裂增殖速度加快。为临床应用rADSCs进行皮肤软组织创面的修复提供了数据支持。(3)ADSCs自身还具有向损伤部位归巢的特性,在损伤部位除向表皮细胞分化外,还促进表皮细胞分裂增殖。(4)成体脂肪源性干细胞可以作为体内基因治疗的载体,促进创面修复与再生。(5)含ADSC的自体脂肪组织可用于创面治疗,有效提高创面的愈合速度和愈合质量。


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