氨基糖苷类药物对铜绿假单胞菌耐药突变选择窗的实验研究

【摘要】： 【目的】建立防耐药变异浓度(Mutant Prevention Concentration，MPC)体外测定方法，并测定氨基糖苷类药物妥布霉素、阿米卡星和庆大霉素对铜绿假单胞菌ATCC27853的MPC和耐药突变选择窗(Mutant Selection Window，MSW)，结合已有的药代动力学参数，评价不同氨基糖苷类药物的MSW大小及抑制耐药突变株选择的能力。同时观察氨基糖苷类药物浓度对耐药突变株恢复生长和氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因检出的影响。在以上体外实验的基础上，以妥布霉素-铜绿假单胞菌ATCC27853为例，从动物体内水平初步验证MSW理论，找出能够预测耐药突变株在体内选择性富集的药代动力学、药效动力学(PK／PD)参数。以期为基于MSW理论的新的临床用药策略提供科学依据，遏制铜绿假单胞菌对氨基糖苷类药物的耐药。 【方法】(1)肉汤法富集10~(10)cfu／ml铜绿假单胞菌，采用琼脂平板稀释法测定妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素对铜绿假单胞菌ATCC27853的MIC、MIC_(99)、MPC和耐药突变菌恢复生长菌落数，并通过对AMEs基因的PCR扩增和测序，明确不同氨基糖苷类药物浓度对AMEs基因检出的影响。(2)建立兔组织笼铜绿假单胞菌ATCC27853感染模型，通过肌肉注射方法分别给予1mg／kg、3mg／kg、20mg／kg、40mg／kg、60mg／kg妥布霉素治疗，使组织笼内药物浓度分别低于MIC_(99)、位于MIC_(99)和MPC之间(MSW内)、高于MPC及在治疗过程中药物浓度有不同时间跨MSW，对照组应用生理盐水肌肉注射。观察组织笼内细菌耐药突变株的选择和MIC变化情况，并采用改良微生物法及液相色谱法测定组织液内妥布霉素浓度，分析组织笼内妥布霉素浓度与出现耐药的关系。 【结果】妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素对铜绿假单胞菌ATCC27853的MPC分别为8、12.5、10.5μg／ml，选择指数(SI)分别为32、12和20。氨基糖苷类药物浓度对铜绿假单胞菌耐药突变株恢复生长菌落数和氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因的检出有明显的影响。 动物体内实验表明，当妥布霉素组织液浓度位于MSW内时，容易导ATCC27853耐药突变株的选择，而药物浓度位于MSW外时，不会出现耐药突变株的选择；当妥布霉素组织液浓度位于MSW内的下半部时，最容易导致耐药突变株的选择；当使组织笼内妥布霉素浓度高于MPC的时间占整个治疗时间的百分比T＞MPC(％)保持在23.21％以上时，可有效地防止ATCC27853耐药突变株在体内的选择性富集扩增；当妥布霉素组织液Cmax高于MIC_(99)但又不能超过MPC时，药物浓度在MSW内的时间占整个治疗时间的百分比Tmsw(％)超过96.7％，就可导致耐药突变株在体内的选择性富集扩增；而当药物浓度在整个用药期间均低于MIC_(99)时，不会导致耐药突变株的选择性富集；当组织笼内妥布霉素Cmax／MIC≥26，或AUC0-24／MIC＞320或AUCO-24／MPC＞20时，可有效防止耐药的发生。 【结论】(1)对于铜绿假单胞菌ATCC27853，妥布霉素限制下一步耐药突变株选择的能力优于庆大霉素和阿米卡星。(2)氨基糖苷类药物浓度对铜绿假单胞菌耐药突变株恢复生长菌落数和AMEs基因检出都有明显的影响。(3)本研究从动物体内水平证明当组织笼内妥布霉素浓度高于MPC时，不会出现耐药突变株的选择性富集；当药物浓度低于MIC_(99)时，也不会导致耐药突变株的选择性富集；只有当药物Cmax不能达到MPC，并且大部分时间位于MSW内时，才容易导致耐药突变株的体内选择并导致耐药。(4)保持药物浓度在MSW内的下半部，最容易导致耐药。(5)MPC理论与T＞MIC_(99)、T＞MPC、Tmsw和Cmax／MIC等相结合可能是预测治疗中是否会发生耐药的较好参数。