喹诺酮药物对金黄色葡萄球菌体内体外耐药突变选择作用的实验研究

【摘要】： 【目的】比较非氟喹诺酮药物(NFQ)奈诺沙星和3种氟喹诺酮(FQ)药物的MIC值和MPC值，了解MSW的范围，评价它们限制耐药突变株选择的能力；观察药物浓度对耐药突变株恢复生长的影响；探讨奈诺沙星对金黄色葡萄球菌的初始作用靶位，及耐药突变体的突变位点；同时也比较奈诺沙星和13种抗菌药物对临床分离革兰阳性和革兰阴性细菌的体外抗菌活性。 【方法】肉汤法富集10~(10)cfu/ml金黄色葡萄球菌，采用琼脂平板稀释法测定NFQ药物奈诺沙星和3种FQ药物环丙沙星、左氧氟沙星和莫西沙星，对金黄色葡萄球菌ATCC25923、环丙沙星敏感和耐药的MSSA、MRSA的MIC、MPC和耐药突变菌恢复生长菌落数，并对金黄色葡萄球菌ATCC25923在突变选择窗内筛选出的第一步和第二步突变体，应用PCR扩增及DNA测序方法，确定耐药突变位点。采用琼脂平板二倍稀释法检测奈诺沙星和13种抗菌药物对临床分离MSSA(60株)、MRSA(47株)、表皮葡萄球菌(30株)、肺炎链球菌(51株)、大肠埃希菌(29株)、肺炎克雷伯杆菌(28株)、鲍曼不动杆菌(23株)和铜绿假单胞菌(29株)的MIC。 【结果】(1)对金黄色葡萄球菌ATCC25923，奈诺沙星、莫西沙星、左氧氟沙星和环丙沙星的MPC值分别为0.2μg/ml、0.21μg/ml、0.8μg/ml和1.8μg/ml，选择指数(MPC/MIC_(99))分别为：7.1、7.1、8.0和10.6。(2)奈诺沙星和FQ药物浓度对金黄色葡萄球菌耐药突变株恢复生长菌落数有明显的影响。(3)4株奈诺沙星第一步耐药突变体在gyrA基因86位，gyrB基因439位和440位有碱基突变，但均未引起氨基酸替换。而4株第二步耐药突变体在第一步突变体的基础上，新发生了gyrA基因Ser-84→Leu位点突变。所有奈诺沙星筛选菌株的grlA基因均未见耐药位点突变。(4)对环丙沙星敏感的MSSA，环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和奈诺沙星的MPC_(90)分别为8.0μg/ml、2.0μg/ml、0.5μg/ml和0.25μg/ml，选择指数(MPC_(90)/MIC_(90)比值)由高到低依次为：奈诺沙星=莫西沙星＜左氧氟沙星=环丙沙星。对环丙沙星敏感MRSA，环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和奈诺沙星的MPC_(90)分别为16.0μg/ml、8.0μg/ml、4.0μg/ml和2.0μg/ml，选择指数由小到大依次为：奈诺沙星=莫西沙星＜左氧氟沙星=环丙沙星。对环丙沙星耐药MSSA，奈诺沙星和莫西沙星的MPC_(90)分别为4.0μg/ml、32.0μg/ml，选择指数分别是8和16。对环丙沙星耐药MRSA，奈诺沙星和莫西沙星的MPC_(90)分别为16.0μg/ml和＞32.0μg/ml，选择指数分别是32和＞4。(5)奈诺沙星对MSSA、MRSA、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌的MIC_(90)分别是0.5μg/mL，1.0μg/ml、0.5μg/ml和0.5μg/ml，对多重耐药的肺炎链球菌和MRSA均具有较强的抗菌活性。奈诺沙星对大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌MIC_(90)分别是8.0μg/mL，8.0μg/ml、32μg/ml和8.0μg/ml，较3种氟喹诺酮和其他抗菌药物，无明显抗菌优势。 【结论】(1)对于金黄色葡萄球菌ATCC25923，奈诺沙星限制下一步耐药突变株选择能力强于左氧氟沙星和环丙沙星，与莫西沙星相当。(2)对于金黄色葡萄球菌，DNA促旋酶是奈诺沙星初始作用靶位。Ser-84→Leu可能是对奈诺沙星耐药影响最重要的位点。(3)无论对环丙沙星敏感还是耐药的MSSA和MRSA，奈诺沙星较FQ药物(环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星)都具有更好的抗菌活性和阻止下一步耐药突变株选择的能力。结合药代动力学参数，对环丙沙星敏感的MSSA、MRSA和环丙沙星耐药的MSSA，奈诺沙星单药治疗即可限制耐药突变株的选择，但对环丙沙星耐药的MRSA却无此作用。(4)奈诺沙星可作为治疗FQ耐药的MSSA、MRSA和肺炎链球菌感染的可选药物之一，但对革兰阴性菌感染的治疗，奈诺沙星并不比FQ药物有优势。 【目的】测定左氧氟沙星对体内增殖到10~(10)cfu/ml金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC和MPC。在动物体内水平，探讨左氧氟沙星药代、药效动力学(PK/PD)参数与金黄色葡萄球菌耐药发生的MSW上限和下限的相关性，确定最有预测性的防止耐药发生PK/PD参数。 【方法】(1)在兔背部皮下植入1个无菌多孔、中空的塑料球，4周后球内充满组织液，建成兔组织笼模型。(2)将3×10~7-3×10~9cfu金黄色葡萄球菌ATCC25923注入组织笼内增菌到10~(10)cfu/ml，建立兔组织笼金黄色葡萄球菌感染模型。(3)高剂量治疗组动物给予20mg/kg、3次/天，30mg/kg、2次/天，60mg/kg、1次/2天左氧氟沙星灌胃治疗5天，使组织液内药物浓度在大部分治疗时间在MPC附近，低剂量治疗组动物分别给予2.5mg/kg、3次/天，3.5mg/kg、2次/天，6mg/kg、1次/2天左氧氟沙星灌胃治疗5天，以确保组织液内药物浓度在大部分治疗时间在MIC附近。对照组应用生理盐水灌胃。采用液相色谱法测定组织液内左氧氟沙星浓度，并进行药代动力学测定，计算PK/PD参数，同时监测用药后组织液内细菌药物敏感性变化。 【结果】(1)左氧氟沙星对体内增菌的ATCC25923的MIC、MIC_(99)和MPC分别为0.125μg/ml，0.1μg/ml和0.8μg/ml，与测定体外富集细菌的结果完全一致。(2)改变给药剂量和频次后，AUC/MPC＞25h和C_(max)/MPC＞1.2是预测防止耐药出现的MSW上限的最佳PK/PD参数。AUC/MIC≤20h、T＞MIC小于等于20％或T_(msw)≤20％则是与限制突变体选择的MSW下限相关性最好的PK/PD参数。考虑传统药效动力学，AUC/MPC＞25h和AUC/MIC≤20是预测防止耐药发生的最佳PK/PD参数。 【结论】(1)体外富集细菌的MIC、MPC值，能够反映抗菌药物对体内增殖细菌的敏感性及限制下一步突变体选择的能力。(2)防止耐药发生的MSW上、下限的PK/PD参数分别为AUC/MPC=25h和AUC/MIC=20h。保持药物的AUC/MPC＞25h或AUC/MIC≤20可以限制耐药发生。