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乙型脑炎病毒NS1基因原核表达及脑炎抗体检测方法的初步研究

李波  
【摘要】: 目的:克隆乙型脑炎病毒NS1基因,构建NS1基因原核表达载体并在E.coil中进行表达,通过Ni-NTA柱纯化重组蛋白,并将纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立检测血清乙型脑炎病毒IgG抗体的方法,为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法,同时也为乙型脑炎病毒理论研究提供基础。 方法:(1)乙型脑炎病毒NS1基因的克隆及序列测定:将乙型脑炎病毒接种Vero细胞,待细胞病变明显后,收集细胞悬液,利用RT-PCR技术扩增乙型脑炎病毒NS1基因,用胶回收试剂盒回收目的片段,将回收产物与克隆测序载体PGEM-T载体连接后进行测序。(2)原核表达载体的构建及鉴定:扩增产物和质粒pET-28a(+)用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,用胶回收试剂盒回收目的片段,将载体和目的插入片段用T4连接酶进行连接,获得pET-28a(+)-NS1重组质粒。将pET-28a(+)-NS1重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,抽提质粒进行双酶切鉴定和PCR初步鉴定,经初步鉴定后进行测序鉴定。(3)重组质粒的诱导表达:抽提重组质粒pET-28a(+)-NS1后转化表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并摸索最佳表达条件,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步观察重组蛋白NS1的表达量并对其进行初步的分析。(4)表达蛋白的纯化及抗原性分析:将含有目的基因的宿主菌接种液体培养基进行增菌并大量表达,表达后的蛋白通过Ni-NTA柱进行免疫亲和层析,获得高纯度的表达蛋白。并用Western-bloting检测表达蛋白的抗原性。(5)病毒NS1蛋白快速检测ELISA法的建立:将纯化抗原包被聚丙乙烯板,建立间接ELISA方法检测抗JEV-NS1抗体。 结果:(1)乙型脑炎病毒NS1基因PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳,产物为单一条带,大小约为1300bp。用特异性引物对重组质粒pET-28a(+)-NS1进行序列测定,测定结果与文献报道的NS1基因序列一致。(2)用重组质粒转化宿主表达菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导表达出Mr为46KD左右的重组蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高,表达量占全菌蛋白质的33%,经Ni-NTA柱纯化,获得纯度为89.3%的重组蛋白,Western-bloting证实表达蛋白具有良好的抗原性,。(3)以纯化蛋白为包被抗原建立了检测血清抗NS1抗体的间接ELISA方法,结果显示,在抗原稀释度为1:10时为最佳工作浓度。 结论:成功地构建原核表达载体pET-28a(+)-NS1,并获得重组NS1蛋白,为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法,同时也为乙型脑炎病毒基础研究提供基础。将重组蛋白作为检测抗原制备抗体检测ELISA,并进行了实验条件优化,下一步的工作需要收集部分患者血清进行临床验证。


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