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Ranibizumab抑制BN大鼠脉络膜新生血管的实验研究

丁振强  
【摘要】: [课题研究背景]脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)是眼内新生血管的重要表现形式之一,与眼部多种疾病有关,如年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)、特发性脉络膜视网膜炎、眼组织胞浆菌病、高度近视黄斑变性,以及眼部肿瘤和眼外伤等,其中AMD是发达国家老年人视力丧失的首要原因。CNV常累及黄斑,引起反复出血、渗出、瘢痕形成,严重损害中心视力。迄今为止,CNV相关疾病的治疗仍是眼科学研究领域的热点之一。CNV的发生机制尚不清楚,普遍认为CNV的生成是一个多细胞因子参与的复杂过程,其中血管生成因子与抑制因子之间平衡的破坏具有关键作用,而血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是最重要的促血管生成因子之一。目前,抗血管内皮生长因子治疗CNV越来越受到各国学者的重视,Ranibizumab正是众多针对VEGF的CNV抑制剂之一。Ranibizumab,又称rhuFabV2,商品名为Lucentis,是第二代人源化的抗VEGF重组鼠单克隆抗体片段(recombinanthumanized antigen-binding fragment,rhuFab)。有可能用于治疗因VEGF所介导的眼部新生血管性疾病。本课题采用视网膜电生理技术、体外细胞培养、形态学观察、组织病理学和功能分类基因芯片研究方法,探讨了Ranibizumab在激光诱导色素鼠脉络膜新生血管形成和发展中的抑制作用及机制。 第一部分Ranibizumab治疗氪激光诱导BN大鼠视网膜功能学变化目的1.研究正常BN大鼠视网膜电图和视觉诱发电位的波形特征和变化范围。2.探讨玻璃体注射Ranibizumab后对氪激光诱导BN大鼠视网膜电图的影响。方法1.应用F-ERG和F-VEP技术记录正常BN大鼠电生理波形。2.采用眼底氪激光光凝30点,诱导建立BN大鼠脉络膜新生血管动物模型。建模后3d治疗组玻璃体内注射Ranibizumab,采用ISCEV建议的视网膜电图标准五项记录各组不同观察时间点(3d、1w、2w、4w)视网膜电图波形。结果1.随着刺激光强度的增加BN大鼠暗适应视网膜电图的a、b波的潜伏期逐渐缩短,幅值逐渐升高;随着刺激闪光强度的增加BN大鼠闪光VEP的P波的潜伏期逐渐缩短,幅值无明显变化;2.激光诱导后不同时间点,暗适应视网膜最大反应视网膜电图的a、b波潜伏期均无明显变化,视网膜电图的a、b波幅值逐渐降低;Ranibizumab治疗后4w,视网膜电图b波幅值完全恢复正常。结论记录出正常BN大鼠视觉电生理图形波动和变化范围;Ranibizumab可以改善氪激光诱导的BN大鼠视网膜功能。 第二部分Ranibizumab抑制huvec和RPE细胞增殖和迁移的实验研究目的探讨Ranibizumab对人脐静脉内皮和视网膜色素上皮细胞增殖和迁移能力的影响。方法采用MTT比色法,观察不同浓度的Ranibizumab对huvec和RPE细胞增殖的影响,Transwell小室检测Ranibizumab对huvec和RPE细胞迁移的影响。结果1.MTT比色法显示,Ranibizumab对huvec和RPE细胞增殖具有抑制作用,随着浓度的增加,Ranibizumab对huvec和RPE细胞增殖抑制作用也增强。2.Ranibizumab浓度为0.01、0.1、1mg/ml时迁移至Transwell小室膜下的huvec细胞数分别为112.68±10.03、58.17±6.52、31.67±4.84(P<0.01 vs con)。穿膜的RPE细胞数分别为162.4±14.5、82.64±11.9、56.3±10.7,而对照组为171.2±9.2个。0.1mg/ml和1mg/ml药物干预组迁移的RPE细胞个数明显减少(P<0.01 vs con)。结论Ranibizumab能够抑制huvec和RPE细胞的增殖和迁移,且具有明显的浓度依赖性,这可能是其抑制血管生成的途径之一。 第三部分Ranibizumab治疗氪激光诱导BN大鼠CNV的形态学研究目的在体研究Ranibizumab治疗后氪激光诱导BN大鼠CNV的形态学变化。方法氪激光诱导BN大鼠CNV后2w,应用FFA、HE染色和FITC标记的铺片免疫组化形态学方法观察Ranibizumab对CNV的抑制作用。结果Ranibizumab治疗后2w,HE染色BN大鼠CNV相对厚度变薄;FFA结果显示激光斑渗漏评分分值降低;FITC铺片标记CNV荧光面积减少。结论体内实验结果表明Ranibizumab对氪激光诱导的BN大鼠CNV有明显的抑制作用。 第四部分氪激光诱导BN大鼠CNV及玻璃体内注射Ranibizumab后 功能分类基因芯片表达变化的实验研究 目的1.观察氪激光诱导BN大鼠CNV后不同观察时间点视网膜-脉络膜-巩膜复合体基因表达的变化。2.检测玻璃体内注射Ranibizumab后2wBN大鼠视网膜-脉络膜-巩膜复合体基因表达的变化。方法应用大鼠血管生成功能分类基因芯片(119个基因)检测氪激光诱导BN大鼠CNV及玻璃体内注射Ranibizumab后功能分类基因芯片表达变化。结果1.在激光光凝后3d、1w时,上调基因大多是CCL、IL、PDGF等促炎性反应因子。光凝后2w,上调基因以VEGF、TGF、TNF等促新生血管因子表达上调为主。2.与CNV2w组相比,玻璃体注射Ranibizumab后(CNV 2w-T组),CNV2w-T组/CNV2w组上调基因14个,下调基因11个,与相应基因位置比对后可见,Ranibizumab治疗后VEGF、VEGF受体KDR、TGF等新生血管促进基因明显下调。结论1.在氪激光诱导CNV的早期阶段(诱导后3d和1w),表现为眼部的炎症反应和免疫活化在CNV的早期发生和发展中起重要作用。2.在CNV的早期阶段(炎性期),单核细胞(MPC-1诱导)从循环中进入损伤部位活化为巨噬细胞,分泌多种因子扩大炎症反应。3.激光诱导后2wCNV形成,表现为RPE和EC细胞的活化释放各种促新生血管基因的上调表达,促炎性基因的下调或消失,参与新生血管生成的调控,此阶段血管生长因子和抑制因子之间平衡的破坏是血管生成的关键因素之一。4.Ranibizumab治疗后,有效的阻止了VEGF和其受体基因的表达,从而明显抑制了CNV的生长。


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