地黄低聚糖联合骨髓间充质干细胞移植治疗心力衰竭的实验研究

【摘要】： 背景: 传统中药地黄具有补肾、益气、养血功能,地黄低聚糖(RGOs)是从地黄中提取的低分子量多糖成分,现代药理研究发现其具有促进骨髓造血干细胞增殖、调节免疫、保护心肌等作用。中医脏腑学说认为“肾”是储藏“先天之精的”器官,肾虚是心衰的主要发病机制。现代中医理论认为干细胞的产生、增殖及功能均与“先天之精”有密切关系,因此,地黄低聚糖可能影响来源于骨髓的间充质干细胞(MSCs)的生物学特性,联合MSCs移植治疗心衰可能产生有益作用。 目的: 观察骨髓间充质干细胞移植治疗心力衰竭时RGOs的治疗作用,并在离体细胞培养水平探索这种治疗作用的产生机制。 方法: 第一部分:分离成年大鼠MSCs,给予不同浓度RGOs干预,用MTT方法检测其对MSCs增殖的影响;取第8代MSCs进行分组诱导:RGOs组、5-氮胞苷(5-Aza)组、RGOs加5-Aza组,并设空白对照组,采用干化学法、免疫荧光法和Western-blot法等分别检测诱导后MSCs内CK-MB、cTnI、CX 43等心肌特异性物质的表达和ERK1/2蛋白的表达及活化情况,流式细胞仪检测MSCs向心肌样细胞的转化率,观察RGOs对MSCs向心肌样细胞分化的作用及机制。 第二部分:选用50只Wistar大鼠,取4只作为细胞供体处死以取得骨髓间充质干细胞进行培养备移植用,取6只作为正常对照组,剩余40只制备心力衰竭模型,给予腹腔注射阿霉素(总剂量15mg/kg)。末次注射后,观察4周,对存活的36只心衰模型大鼠,随机分为心衰模型组、MSCs移植组、RGOs联合MSCs移植组、RGOs组。通过重复尾静脉注射的方式进行同种异体MSCs移植,移植前MSCs用DAPI进行标记,移植后RGOs联合MSCs移植组和RGOs组给予RGOs粗提物200mg/kg/d灌胃。4周后行超声心动图检测心脏功能;心脏标本切片于荧光显微镜下观察移植细胞是否归巢到心脏;Ⅷ因子免疫组化染色计算心肌组织毛细血管密度;左室心肌组织行天狼猩红染色,计算胶原容积分数(CVF)。 结果: 第一部分:本研究观察到,RGOs可明显促进离体培养的MSCs增殖,最佳浓度为100μg/ml。各诱导组均显著表达CK-MB、cTnI、CX 43,未诱导组阴性或仅有极微弱的表达,以RGOs联合5-Aza组MSCs向心肌样细胞的转化率最高。RGOs组ERK1/2蛋白的活化形式表达最强。 第二部分:超声心动图结果显示,与正常组相比,造模各组的射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)均明显下降(P＜0.05),室壁运动减弱,室壁变薄。与心衰组相比,各治疗干预组的心脏收缩功能均有改善,表现为EF、FS升高,左室内径下降,毛细血管密度增加,左室CVF降低,以RGOs联合MSCs移植组效果最明显,但与单纯MSCs移植组和RGOs组比较,除毛细血管密度达统计学差异(P＜0.05)外,心功能参数和CVF均未达统计学差异(P＞0.05)。荧光显微镜下观察,进行细胞移植的大鼠心肌切片上有DAPI标记的细胞,RGOs联合MSCs移植组DAPI阳性细胞数目多于单纯MSCs移植组。 结论:RGOs可以促进离体大鼠MSCs的增殖,并诱导MSCs向心肌样细胞分化,ERK1/2途径激活可能是其机制之一。在心衰大鼠模型中,MSCs移植、RGOs联合MSCs移植和RGOs治疗均可以有效改善心衰大鼠的心功能,促进血管新生,减少纤维化;RGOs和MSCs移植联合具有协同作用。