收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

烧伤后高迁移率族蛋白B1对调节性T细胞免疫功能影响的实验与临床研究

黄立锋  
【摘要】: 目的: 实验一:(1)采用严重烫伤延迟复苏动物模型,明确高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的变化及其与调节性T细胞(Treg)免疫功能的关系。(2)通过严重烫伤延迟复苏动物模型,阐明HMGB1对Treg分化成熟的受体作用机制。(3)探讨严重烫伤延迟复苏后HMGB1介导的Treg对树突状细胞(DC)免疫功能的影响及调节作用。(4)探讨严重烫伤延迟复苏后HMGB1介导的Treg对T淋巴细胞免疫功能的影响及调节途径。(5)观察丙酮酸乙酯(EP)对重度烫伤延迟复苏动物免疫功能及脏器损害的可能保护效应。 实验二:(1)对临床严重烧伤患者进行动态监测,明确严重烧伤后病人外周血HMGB1、Treg分化成熟以及T淋巴细胞免疫功能的变化规律,探讨HMGB1、Treg及T淋巴细胞免疫功能改变在患者烧伤后发生脓毒症及不良预后中所起的作用及临床意义。(2)探讨严重烧伤后HMGB1、Treg及T淋巴细胞免疫指标间的相互关系及可能的作用机制。 方法: 1.采用重度烫伤延迟复苏动物模型,即雄性清洁级Wistar大鼠,浸于沸水中造成30%体表面积Ⅲ度烫伤。伤后延迟6小时抗休克复苏,在伤后6小时从腹腔给予林格液(40 ml/kg)抗休克治疗,此外在烫伤后12、24、36、48小时分别给予4 ml/次林格液腹腔内注射。实验分组:136只大鼠随机分为5组,(1)正常对照组(n=8):麻醉后活杀;(2)假烫伤组(n=32);(3)烫伤组(n=32);(4)EP治疗组(n=32):EP加入林格液中随补液给药(EP为28 mM);(5)晚期糖基化终末产物受体(RAGE)抗体(1 mg/ml)治疗组(n=32):烫伤后6、24小时从阴茎背静脉给予RAGE抗体(1 mg/kg)治疗。以上后4组实验动物再分为4个亚组,分别于烫伤后1、3、5、7天处死动物,无菌留取血和脾脏标本。分离血清,-20℃贮存。脾脏一部分无菌、无酶液氮冻存,另一部分用于提取Treg、DC和T淋巴细胞。Treg、DC的分离纯化采用MiniMACS免疫磁性分离系统进行。利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性,分离T淋巴细胞。采用流式细胞术检测细胞免疫表型和细胞表面受体,MTT法检测脾T淋巴细胞增殖,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清、细胞孵育上清及组织匀浆液的细胞因子和T淋巴细胞活化的核因子(NF)-kB。采用荧光定量PCR检测目的基因表达水平。 2.对106例烧伤总面积大于或等于30%的患者进行动态观察,对所采集临床病历资料进行分析。实验分组:(1)按烧伤总面积将患者分为三组:Ⅰ组41例(烧伤总面积30%~49%),Ⅱ组34例(烧伤总面积50%~69%),Ⅲ组31例(烧伤总面积70%~99%);(2)根据烧伤脓毒症的诊断标准,将患者进一步分为脓毒症组(59例)与非脓毒症组(47例);(3)根据脓毒症患者的预后情况,将其分为死亡组(17例)与存活组(42例)。同时设正常对照组(25位健康献血员)。分别于烧伤后1、3、7、14、21天采集患者外周静脉血,分离外周血T淋巴细胞,采用MiniMACS免疫磁性分离系统对外周血Treg进行分离纯化,同时分离血清,-20℃贮存。采用流式细胞术检测细胞免疫表型,MTT法检测T淋巴细胞增殖活性,ELISA检测血清HMGB1及细胞孵育上清的细胞因子水平,采用荧光定量PCR检测目的基因表达水平。 结果: 实验一:(1)烫伤延迟复苏导致动物脾脏HMGB1基因、蛋白表达和血清HMGB1水平在伤后1~7天显著升高,脾组织中HMGB1含量第1天达峰值,血清HMGB1水平于第3天达峰值。EP干预后烫伤动物脾脏HMGB1基因、蛋白表达和血清HMGB1水平1~7天均明显降低。RAGE抗体干预对烫伤动物脾脏和血清HMGB1无明显影响。(2)严重烫伤后脾脏Treg表面分子CTLA-4的表达1~5天明显增强,表面标记物Foxp3的表达1~7天明显增高,与假烫伤动物比较差异显著,表明严重烫伤可促使Treg成熟。EP及RAGE抗体干预组动物脾脏Treg表面CTLA-4和Foxp3的表达明显降低,与烫伤组比较均有统计学差异,提示EP处理和RAGE抗体干预可抑制Treg成熟。(3)严重烫伤后1~7天动物脾脏Treg表面RAGE的表达明显增强。EP干预后脾脏Treg表面RAGE的表达于1~7天显著降低,但仍明显高于假烫伤组。RAGE抗体干预后Treg表面RAGE表达1~7天显著降低。(4)烫伤延迟复苏后动物脾脏IL-10 mRNA表达以及Treg孵育液中IL-10含量明显增高。EP或RAGE抗体干预后,烫伤动物脾脏IL-10 mRNA表达和Treg孵育液中IL-10含量在伤后1~7天明显降低。(5)严重烫伤后1~7天脾脏DC表面CD80的表达与假烫伤组比较无统计学差异,CD86表达明显增强,MHCⅡ的表达仅在伤后第1天明显增高,DC摄取葡聚糖的能力与假烫伤组比较1~7天明显减低,表明DC向成熟发展,但表型表达不完全。EP或RAGE抗体干预后烫伤动物脾脏DC表面CD80、MHCⅡ的表达1~7天均明显升高,CD86的表达仍保持较高,DC摄取葡聚糖的能力在1~7天仍较低,表明DC成熟,表型表达趋于正常。(6)烫伤延迟复苏后1~7天脾T淋巴细胞增殖反应受抑制,IL-2mRNA表达1、3天无改变,5、7天明显降低,分泌IL-2的量1~7天显著下降,IL-2RαmRNA、IL-2Rα蛋白表达1~5天明显降低。EP或RAGE抗体干预能明显减轻1~7天烫伤对脾T淋巴细胞增殖的抑制,并且IL-2 mRNA表达、IL-2的分泌和IL-2RαmRNA、IL-2Rα表达明显上升。(7)严重烫伤后动物脾T淋巴细胞分泌IL-4的量比假烫伤组明显增加,而分泌IFN-γ的量显著降低,提示严重烫伤后T淋巴细胞向Th2漂移。用EP或RAGE抗体干预后,烫伤动物脾T淋巴细胞分泌IL-4的量明显下降,分泌IFN-γ水平则明显升高,提示EP或RAGE抗体干预可使烫伤后T淋巴细胞向Th1漂移。(8)烫伤组与假烫伤组比较,大鼠脾脏T淋巴细胞NF-kB活性伤后1~7天明显降低。应用EP或RAGE抗体干预均可明显提高1~7天烫伤动物脾T淋巴细胞NF-kB活性。(9)烫伤组与假烫伤组比较,大鼠血中丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)及心肌激酶(CK-MB)伤后1~7天明显升高,血中肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)1~5天明显升高。EP或RAGE抗体干预可明显降低烫伤后动物血清ALT、AST、Cr、BUN及CK-MB含量。(10)脾组织中HMGB1含量与Treg表面CTLA-4、Foxp3、RAGE、IL-10的表达呈正相关。脾组织中HMGB1含量与脾T淋巴细胞增值反应、表面IL-2Rα表达、孵育上清中IL-2、IFN-γ含量、NF-kB活性呈负相关,与血清sIL-2R含量、孵育上清中IL-4含量呈正相关。血清HMGB1含量与血清生化指标ALT、AST、Cr、BUN及CK-MB水平均呈正相关。 实验二:(1)与正常对照组比较,严重烧伤患者不同烧伤面积组T淋巴细胞HMGB1基因表达及血浆HMGB1水平均明显升高,Ⅰ组与Ⅲ组比较存在明显差异;严重烧伤患者伤后各时间点HMGB1基因表达及血浆HMGB1水平均明显升高,脓毒症组HMGB1基因表达及血浆HMGB1水平在伤后7~21天显著高于非脓毒症组;脓毒症患者死亡组HMGB1基因表达及血浆HMGB1水平在伤后3~21天显著高于存活组。(2)与正常对照组比较,严重烧伤患者各烧伤面积组Treg表面分子CTLA-4及标记物FOXP3表达均明显增强,各组间比较存在明显差异;严重烧伤患者伤后不同时间点CTLA-4及FOXP3表达均明显升高,脓毒症组CTLA-4及FOXP3表达在伤后3~21天显著高于非脓毒症组;脓毒症患者死亡组CTLA-4及FOXP3表达在伤后3~21天显著高于存活组。(3)与正常对照组比较,严重烧伤患者不同烧伤面积组Treg IL-10基因/蛋白表达及TGF-β1水平均显著升高,各组间比较存在明显差异;严重烧伤患者伤后各时间点Treg IL-10基因/蛋白表达及TGF-β1水平均明显升高,脓毒症组Treg IL-10基因/蛋白表达及TGF-β1水平在伤后3~21天显著高于非脓毒症组;脓毒症患者死亡组Treg IL-10基因/蛋白表达及TGF-β1水平在伤后3~21天显著高于存活组。(4)与正常对照组比较,严重烧伤患者各烧伤面积组外周血T淋巴细胞增殖反应活性及IL-2基因/蛋白表达水平均明显降低,Ⅰ组与Ⅲ组比较存在明显差异;严重烧伤患者伤后T淋巴细胞增殖反应活性及IL-2基因/蛋白表达水平均明显降低,脓毒症组T淋巴细胞增殖反应活性及IL-2基因/蛋白表达水平在伤后3~21天显著低于非脓毒症组;脓毒症患者死亡组T淋巴细胞增殖反应活性及IL-2基因/蛋白表达水平在伤后3~21天显著低于存活组。(5)与正常对照组比较,严重烧伤患者各烧伤面积组T淋巴细胞分泌IL-4水平明显升高,而分泌IFN-γ水平显著降低;与Ⅰ组比较,Ⅲ组IL-4分泌水平明显升高,而IFN-γ分泌水平显著降低;严重烧伤患者伤后各时间点T淋巴细胞分泌IL-4水平明显升高,而分泌IFN-γ水平显著降低;脓毒症组T淋巴细胞分泌IL-4/IFN-γ水平在伤后3~21天显著高/低于非脓毒症组;脓毒症患者死亡组T淋巴细胞分泌IL-4/IFN-γ水平在伤后3~21天显著高/低于存活组。(6)血浆HMGB1含量与Treg及T淋巴细胞各实验组相关免疫指标均无明显相关性。Treg各实验组免疫指标(部分或全部)与T淋巴细胞分泌IL-4水平呈正相关,与T淋巴细胞增值反应活性、IL-2及IFN-γ分泌水平呈负相关。 结论: 实验一:(1)HMGB1在严重烫伤后具有升高较晚、持续时间较长的特征。HMGB1可能参与了烫伤后脓毒症所致多器官损害的发病过程。(2)HMGB1的持续升高可刺激Treg向成熟发展,从而介导T淋巴细胞增殖反应低下,并向Th2漂移,免疫功能抑制。(3)烫伤后大量的HMGB1可能主要通过受体RAGE介导Treg表型表达、Treg功能成熟。(4)HMGB1介导的Treg功能成熟可影响烫伤后DC细胞向成熟发育,但其表型表达异常,功能出现障碍。(5)HMGB1介导的Treg功能成熟还可通过下调T淋巴细胞NF-kB活性而减少了IL-2基因表达和蛋白合成,进而影响T淋巴细胞的增殖反应和免疫功能。(6)EP可能主要通过抑制HMGB1的合成释放,改善烫伤延迟复苏动物细胞免疫功能紊乱,保护动物的主要脏器功能。 实验二:(1)HMGB1在严重烧伤后具有增高较晚、持续时间较长的特征,其含量与烧伤严重程度、并发脓毒症及患者预后相关,HMGB1参与了严重烧伤后机体免疫紊乱、发生脓毒症并致患者死亡的病理过程。(2)严重烧伤后Treg功能向成熟发展,使其免疫抑制功能充分发挥,从而可能导致机体的免疫功能紊乱。其表面分子表达及细胞因子分泌在不同烧伤面积、是否并发脓毒症及是否存活等不同组间存在显著差异,Treg可通过分泌抑制性细胞因子参与了严重烧伤后机体免疫失衡、诱发脓毒症甚至最终造成患者死亡的病理过程。(3)严重烧伤后T淋巴细胞免疫功能受到抑制,并引起T淋巴细胞向Th2漂移。烧伤程度越重、脓毒症发生率和患者死亡率越高,机体免疫抑制状态也越明显。(4)HMGB1含量与Treg及T淋巴细胞相关免疫指标均无明显相关,而Treg免疫指标与T淋巴细胞免疫功能指标间存在显著相关性(正相关或负相关)。说明Treg可能对严重烧伤后T淋巴细胞免疫功能低下,并出现Th1向Th2极化现象具有重要影响。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 ;严重烧伤患者骨骼肌分解代谢的决定因素[J];中国临床康复;2002年24期
2 詹剑华,毛远桂,张红艳,曾元临,李国辉;严重烧伤患者细胞免疫功能研究[J];中国微循环;2004年01期
3 常耕卫;施耘;高志刚;刘群;;严重烧伤患者压力——容量曲线的临床应用[J];中国城乡企业卫生;2006年03期
4 吴天斌;邬薇薇;陈粹;;乌司他丁对严重烧伤患者早期脏器功能的保护作用[J];现代实用医学;2007年08期
5 刘晓雪;蔡兴东;周庆红;;高龄严重烧伤患者早期抗休克综合治疗疗效分析[J];中国民康医学;2007年14期
6 刘健;施燕;窦懿;张勤;廖镇江;;早期应用乌司他丁对严重烧伤患者脏器功能的保护[J];上海交通大学学报(医学版);2008年05期
7 张飙;严重烧伤患者血浆肿瘤坏死因-〆、它的可溶性受体及白细胞介素-1β水平[J];沈阳医学院学报;2000年02期
8 张明谏,王其芳,张玲,宁恩弟,夏修金;严重烧伤患者核黄素营养状况的分析[J];中华烧伤杂志;2000年04期
9 陈璧,贾赤宇,苏映军,徐明达,朱雄翔;严重烧伤患者的早期治疗与功能恢复[J];中国康复;2001年01期
10 杨文东,魏树华,李召芳,刘俊建;大面积严重烧伤患者早期检测血清脂肪酸结合蛋白价值的探讨[J];中国烧伤创疡杂志;2002年03期
11 陈晓东,江琼,吴伯瑜,陈舜,王顺宾;严重烧伤患者血清胰岛素样生长因子-Ⅱ水平的变化及其与感染的关系[J];中国医师杂志;2003年09期
12 韩春茂,谢卫国,许荣锋,陈国贤;严重烧伤患者应用重组人生长激素的时机——胰岛素样生长因子轴及血糖的变化分析[J];中华烧伤杂志;2003年04期
13 李华强;严重烧伤患者抗休克治疗176例分析[J];中国煤炭工业医学杂志;2004年12期
14 田社民,赵耀华,牛希华,马爱霞,刘凤云,魏莹,娄季鹤,李允;严重烧伤患者实施有创动脉血压监测[J];实用诊断与治疗杂志;2005年04期
15 金睿;王月;孙颖;孙萌萌;;严重烧伤患者预防便秘的饮食指导[J];武警医学;2006年02期
16 范友芬;许小敏;;严重烧伤患者早期血清C反应蛋白的变化[J];浙江实用医学;2006年01期
17 周继涛;陈梅娣;肖筑容;;严重烧伤患者围手术期的整体疗法[J];深圳中西医结合杂志;2006年04期
18 张业龙;田社民;李允;;15年严重烧伤患者感染细菌变迁及耐药情况分析[J];医药论坛杂志;2007年11期
19 邬薇薇;吴天斌;陈粹;;乌司他丁对严重烧伤患者多脏器功能的保护作用[J];浙江医学;2008年01期
20 易小进;张敏;;中央静脉插管在严重烧伤患者救治中的应用[J];中国实用医药;2008年33期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘静杰;胡森;盛志勇;隋志甫;朱敬民;;严重烧伤患者单核细胞免疫功能的体外研究[A];第六届全国烧伤救治专题研讨会论文汇编[C];2009年
2 岳丽青;蒋冬梅;黄晓元;;严重烧伤患者康复期生活质量调查及其相关因素的分析[A];第六届全国烧伤救治专题研讨会论文汇编[C];2009年
3 李宗瑜;孙曼;黄丽滨;毛烨;;成人严重烧伤患者营养支持临床特点(1)[A];第三届重症医学大会论文汇编[C];2009年
4 陈旭;张国安;陈忠;宁方刚;王成;;早期处理延迟的严重烧伤患者的救治[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年
5 蔡晨;徐庆连;胡宏;戚伟伟;;血必净对严重烧伤患者炎症反应影响的临床研究[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年
6 蔡晨;徐庆连;胡宏;戚伟伟;;ω-3脂肪乳对严重烧伤患者炎症反应影响的临床研究[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年
7 张红艳;丁志辉;;严重烧伤患者热休克蛋白70的表达及意义[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年
8 田社民;魏莹;查新建;黄红军;牛希华;张红卫;何建民;苏卫国;李延仓;;严重烧伤患者围手术期病情变化的分析[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年
9 肖长辉;;严重烧伤患者血小板计数的变化及意义[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年
10 詹剑华;毛远桂;张红艳;曾元临;李国辉;;严重烧伤患者细胞免疫功能的研究[A];全国烧伤创面处理、感染专题研讨会论文汇编[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 刘静杰;严重烧伤患者单核细胞HLA—DR表达规律的临床与实验研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2003年
2 黄立锋;烧伤后高迁移率族蛋白B1对调节性T细胞免疫功能影响的实验与临床研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前7条
1 杨澎;严重烧伤患者补充不同剂量的核黄素后其营养状况变化的研究[D];天津医科大学;2009年
2 吴迎春;严重烧伤患者休克期血清心肌肌钙蛋白T的变化及其临床意义[D];新疆医科大学;2005年
3 姜鹏君;两种重组人生长激素对严重烧伤患者临床疗效观察及安全性比较[D];南昌大学;2012年
4 董宁;CD14基因多态性与严重烧伤患者细胞免疫功能改变的相关性研究[D];第四军医大学;2008年
5 梁安儒;血必净对严重烧伤患者临床疗效的Meta分析[D];广西医科大学;2013年
6 曾志刚;替普瑞酮诱导HSP60、70高水平表达后对严重烧伤患者急性胃黏膜损伤保护作用的研究[D];南昌大学医学院;2013年
7 刘立柱;烧伤水疱液对间充质干细胞体外培养及表型转化的影响[D];广州医学院;2009年
中国重要报纸全文数据库 前2条
1 张献怀;我国学者揭示烧伤后多器官衰竭发病机制[N];中国医药报;2010年
2 陈士平 白利平 雷鸣;MEBT救治严重烧伤患者体会[N];健康报;2006年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978