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非外源性基因干扰诱导表皮细胞去分化及再生汗腺的临床研究

蔡飒  
【摘要】: 目的:1.体内和体外建立表皮细胞去分化模型,检测与去分化有关的信号通路,确定调控该过程的关键蛋白,为进一步探明表皮细胞去分化发生机制提供理论基础;2.体外诱导骨髓间充质干细胞向汗腺细胞分化,并利用干细胞移植技术促进体内损伤汗腺的修复与再生。 方法:1.将去除基底干细胞层的人表皮片移植到全层皮肤切割伤BALB/c裸鼠皮下,分别于移植后3d、5d和7d取出移植皮片,采用免疫组织化学法、流式细胞检测、Western bloting和RT-PCR法检测移植皮片表型的改变。同样方法处理瘢痕皮片和角膜上皮,通过免疫组织化学染色观察二者表型的改变。2.离体条件下选择热和bFGF作为诱导因素处理成熟表皮细胞。采用细胞化学染色、流式细胞检测和Western bloting观察细胞表型的改变;通过Giemsa染色和电镜检测观察细胞形态的改变;通过二维和滋养层培养体系观察细胞的增殖能力,包括克隆形成和复层生长情况;采用器官培养体系体外构建三维皮肤观察细胞再分化形成表皮情况;应用基因芯片技术观察细胞基因表达的改变。用β-粘连蛋白(β-catenin)激动剂处理细胞观察细胞表型和增殖能力的改变;通过siRNA抑制β-catenin的表达观察其对表皮细胞去分化过程的影响;利用Smad4敲除小鼠间接激活表皮细胞β-catenin,并观察CK14和Ki67在表皮组织内的表达情况。3.体外分离、培养和鉴定人成体骨髓间充质干细胞(MSCs)和人汗腺细胞(SGCs);分别用BrdU或绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记MSCs;将融合的SGCs经47℃高温处理造成体外热损伤休克模型,再加入标记的MSCs共同培养,5d后,检测MSCs表型的改变;将具有汗腺表型的干细胞局部移植于裸鼠烫伤脚掌观察汗腺组织再生修复情况,结合碘.淀粉发汗实验检测汗腺功能以判定治疗效果;选择一例烧伤自愿患者,该患者双上臂背侧均有相似的瘢痕,经发汗实验证明无汗液分泌。经伦理委员会批准和知情同意条件下,抽取其骨髓和切取小块正常皮肤分离培养骨髓间充质干细胞和汗腺细胞进行共培养,诱导骨髓间充质干细胞获得汗腺细胞表型,通过自行设计的方案将该细胞种植于右侧切除瘢痕处。创面愈合后实验侧行发汗实验、汗液成份分析以及组织学检查。 结果:1.去基底细胞层处理的表皮片干细胞标志物CK19和β1整合素染色阴性;移植后5d,存活皮片CK19和β1整合素染色呈多层分布,而不是正常表皮中的单层分布。流式细胞仪检测结果显示,表皮片移植后CK19阳性细胞和β1整合素阳性细胞分别由移植前的0.00%和0.00%增加到7.54%和5.24%,而CK10阳性细胞由99.62%下降为86.56%。Western bloting和PCR检测也证实CK19和β1整合素蛋白水平和mRNA水平表达在移植后明显增强。免疫组化染色显示,去除干细胞的瘢痕表皮和角膜上皮在移植后有大量干细胞标志物CK19、β1整合素和CK14、CK5阳性细胞的分布。2.经热和bFGF诱导后的表皮细胞出现蛋白、形态、功能和基因水平的改变。免疫细胞化学检测显示细胞诱导后CK19和β1整合素染色呈阳性;流式细胞仪检测结果显示CK19和β1整合素阳性率在诱导前分别为0.00%和0.00%,诱导后7d和14d CK19阳性率增加到83.01%和90.42%,β1整合素阳性率增加到83.63%和93.88%;Western bloting检测显示,表皮细胞在去分化诱导前CK19和β1整合素均无表达,诱导后7d和14d CK19和β1整合素出现不同程度的表达。Giemsa染色和透射电镜观察显示细胞诱导后形态发生改变,表现为体积减小,细胞器数目减少,核浆比增大。增殖和再分化能力的改变体现在诱导后的表皮细胞能形成克隆,在滋养层培养条件下可以形成复层生长,并能够在体外构建出包括基底层和基底上层在内的表皮结构。基因水平的改变表现在与角质化相关的基因下调和与有丝分裂相关的基因上调。3.体外激活β-catenin通路可以促使表皮细胞表达CK19和β1整合素,克隆形成和进入细胞分裂周期;而通过siRNA抑制β-catenin的表达可以阻断由热和bFGF诱导的去分化过程。免疫荧光染色显示,Smad4敲除小鼠表皮细胞核内β-catenin表达增强,CK14和Ki67表达阳性细胞大量多层分布于表皮组织内。4.MSCs和SGCs在体外均呈克隆样生长;MSCs表达CD29、CD44、CD71、CD105和CD166,不表达造血干细胞标志CD34和CD45,以及汗腺细胞标志CK19和CEA。加入诱导培养基后MSCs可以向骨和脂肪细胞分化;培养的SGCs表达CK19和CEA;SGCs经高温损伤后,大多数细胞的细胞间连接消失;BrdU或GFP标记的MSCs和损伤的SGCs共培养5d后,部分MSCs表达汗腺细胞标志CK19或CEA;发汗实验和形态学观察证实将具有汗腺细胞表型的干细胞移植于裸鼠创面后,能显著促进受损汗腺的修复与再生。人体移植试验表明,经种植诱导的汗腺细胞后,病人创面愈合部位呈现出汗功能,对照部位发汗实验阴性,形态学检测显示创部真皮浅层经汗腺移植后有大量CEA阳性细胞,结构类似正常汗腺组织。汗液成分分析结果显示治疗处收集的汗液与正常皮肤处收集的汗液具有类似的pH值,渗透压和化学组分。 结论:1.在特定损伤环境和特定因素的诱导下,已分化的表皮细胞可去分化为表皮干细胞或表皮干细胞样细胞。2.表皮细胞的去分化过程与β-catenin/Wnt信号通路有关。3.骨髓间充质干细胞可以在体外成功诱导为汗腺细胞,经移植后,在创面能形成具有功能的汗腺组织。


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