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半相合基因骨髓细胞移植联合抗原免疫治疗小鼠肾癌的实验研究

王希友  
【摘要】: [目的]以全身照射为预处理方案,以半相合基因小鼠为供体,建立骨髓细胞移植的荷瘤鼠模型,探讨半相合基因骨髓细胞移植后受体形成的嵌合体程度对抗肿瘤效应及移植物抗宿主病的影响及其机理;探讨半相合基因骨髓细胞移植联合抗原免疫对抗肿瘤效应及移植物抗宿主病的影响及其机理,从而为进一步的实验研究和临床应用提供理论依据。 [方法]①25只BALB/C青春期小鼠随机分为3组:对照组(c组,5只)、混合型嵌合体组(A组,10只)、完全型嵌合体组(B组,10只)。首先,A、B组小鼠行直线加速器全身照射,剂量分别为4Gy、8Gy,照射后4-6小时内经尾静脉注射入CB6F1代小鼠的骨髓细胞(5×10~6/只),C组无处理。A、B、C三组均给予Renca肾癌细胞腋窝下注射,每只2.6×10~6。观察所有组别小鼠的肿瘤生长速率,通过流式细胞仪测定A、B组小鼠移植后不同时间的嵌合体水平。荷瘤32天时断颈处死小鼠,留取血浆,通过ELISA方法测定血浆IL-2,INF-γ浓度;取肿瘤组织做成石蜡切片后一部分行HE染色,测定肿瘤坏死面积,另一部分组织液氮保存,择期提取肿瘤蛋白后行Western blot测定Fas蛋白表达。②26只BALB/C青春期小鼠中随机分为对照组(F组,6只)、单纯骨髓细胞移植组(D组,10只)、联合抗原免疫移植组(E组,10只)。2组小鼠均行直线加速器全身照射(8Gy),照射后4-6小时内经尾静脉分别注射入CB6F1小鼠的骨髓细胞(5×10~6/只),F组无处理。一周后三组均给予Renca肾癌细胞腋窝下注射,每只2.6×10~6,E组小鼠在荷瘤1天后给予33Gy照射的Renca肾癌细胞(5×10~5)皮下免疫,间隔一周,重复免疫一次。观察所有组别受鼠的肿瘤生长速率,通过流式细胞仪测定移植后不同时间的嵌合体水平。断颈处死小鼠后,留取血浆,通过ELISA方法测定IL-2,INF-γ,水平;取肿瘤组织做成石蜡切片后一部分行HE染色,测定肿瘤坏死面积,另一部分原位末端标记法(TUNEL)检测各组小鼠肿瘤组织的凋亡指数(AI);一部分组织一80℃冻存备用,择期提取肿瘤蛋白后行Westernblot测定Fas蛋白表达。留取移植组小鼠皮肤、肝脏及小肠制备石蜡切片。 [结果]1.流式细胞术鉴定血液白细胞中供者源细胞比例:A组移植后2周后形成混合嵌合体(47.51%-72.64%)并达高峰,以后逐渐下降,3-4周时下降至10%以下。B、D、E组小鼠移植后14d形成完全供者型嵌合体(供体细胞>90%),28d后仍达90%以上。2.与对照组和混合型嵌合体组相比,完全型嵌合体组的肿瘤生长速度明显减慢,肿瘤重量显著减小(p<0.01),抑瘤率高达52%,肿瘤组织坏死面积显著升高(p<0.01),IL-2、IFN-γ,水平升高(p<0.01);各组小鼠肿瘤组织中Fas蛋白几乎不表达。3.与对照组和单纯骨髓细胞移植组相比,联合抗原免疫移植组的肿瘤生长速率明显减慢,瘤重显著减小(p<0.01,p<0.05),IL-2、IFN—γ水平显著升高(p<0.01,p<0.05),抑瘤率高达60%,Fas蛋白表达明显上调,凋亡指数(AI)显著增高(p<0.01)。 [结论]半相合基因骨髓细胞移植后形成的稳定的完全型嵌合体状态是抗肿瘤效应的基础;单纯骨髓细胞移植能够激发小鼠系统性的抗肿瘤免疫反应;半相合基因骨髓细胞移植后抗肿瘤效应的机制可能是肿瘤细胞坏死增多,而与Fas/FasL介导的凋亡无关;半相合基因骨髓细胞移植免疫重建为抗原免疫提供了平台;半相合基因骨髓细胞移植联合抗原免疫可能激发更强的小鼠系统性的抗肿瘤免疫发应;半相合基因骨髓细胞移植联合抗原免疫产生抗肿瘤作用可能通过促进肿瘤细胞坏死和Fas/FasL介导的凋亡增加2个机制产生抗肿瘤效应;半相合基因骨髓细胞移植后产生的GVT与GVHD无关,两者可以分离。


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