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白念珠菌天冬氨酸蛋白酶2真核表达载体的构建及原核表达

李蕾  
【摘要】: 研究背景: 白念珠菌(Candida albicans,C.albicans)是人类最常见的条件致病性真菌(opportunistic pathogen fungi),可引起机体浅部和深部的广泛损害,尤其是侵袭性念珠菌病,诊断困难,治疗也比较棘手,而基因疫苗在预防和治疗该类疾病方面有其独特的优势。然而,由于我们对白念珠菌的致病机制及宿主的免疫应答的认识有限,其疫苗的研制也因此受到限制。本课题主要构建了白念珠菌毒性因子之一的天冬氨酸蛋白酶2适用于原核表达系统和真核表达系统的重组质粒,并且在原核系统中表达并纯化出可溶的目的蛋白;为下一步进行动物免疫及鉴定试验,进而研究天冬氨酸蛋白酶的致病性及免疫机制奠定基础,同时为未来白念珠菌基因疫苗的实施应用提供实验基础。 目的: 构建白念珠菌pCDNA3.1/SAP2表达载体作为基因疫苗;构建Sap2重组原核表达载体并表达、纯化出可溶性的蛋白作为抗原,用于检测接种疫苗后小鼠体内产生的抗体。 方法: 从白念珠菌中提取基因组DNA为模板,用PCR方法获取SAP2基因。将真核表达载体pcDNA 3.1(+)myc-HisC、原核表达载体pET 32a(+)、pMAL-c2x(+)分别与SAP2基因行双酶切,琼脂糖凝胶纯化,连接酶切产物,转化大肠杆菌TOP10感受态细菌,筛选菌落和测序鉴定。用无内毒素的质粒大提试剂盒提取重组真核表达质粒。将重组原核表达载体pET 32a/SAP2、pMAL-c2x/SAP2转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在16℃经IPTG诱导表达出可溶性的融合蛋白。其中pMAL-c2x/SAP2的基因工程菌表达出的融合蛋白经淀粉树脂亲和层析纯化,并用蛋白酶Factor Xa(NEB)切割标签,得到Sap2蛋白。 结果: 1.经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计相同,并定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)myc-HisC中,双酶切后电泳获得预期的SAP2条带,测序证实为正确的SAP2序列。 2.SAP2基因定向插入原核表达载体pET 32a(+)、pMAL-c2x(+)中,测序证实为正确的SAP2序列,阅读框架正确,可以进行目的蛋白的诱导表达。 3.重组原核表达载体pET 32a/SAP2、pMAL-c2x/SAP2的基因工程菌在16℃经IPTG诱导后均表达出可溶性的融合蛋白,其中后者表达的融合蛋白经纯化、切除标签后得到目的蛋白。 结论: 1.成功构建了pcDNA3.1/SAP2真核表达载体,利用高纯度提取试剂盒得到了大量无内毒素的质粒作为基因疫苗的免疫材料。 2.成功构建了pET 32a/SAP2、pMAL-c2x/SAP2原核表达载体,经IPTG低温诱导,可以表达出可溶性的融合蛋白,通过亲和层析及蛋白酶切得到了4mg目的蛋白作为抗原检测试验动物免疫后产生的抗体。


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