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大环内酯类抗菌药对流感嗜血杆菌生物被膜的影响

王瑛  
【摘要】: 细菌生物被膜(bacteria biofilm BBF)可减弱细菌对抗菌药的敏感性,降低膜内药物的有效浓度,导致细菌不能彻底清除,疾病反复发作。慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases COPD)是临床常见的呼吸道疾病,居全球死亡原因的第4位。慢性阻塞性肺疾病急性发作(Acute ExplosionChronic Obstructive Pulmonary Diseases AECOPD)感染的特点是慢性过程急性反复发作,与BBF相关感染特点极其相似。流感嗜血杆菌是是导致AECOPD的主要致病菌之一。研究证实流感嗜血杆菌可在体外建立生物被膜,并逃逸抗菌药及免疫系统的攻击,提示流感嗜血杆菌BBF与AECOPD等慢性疾病的病程进展可能相关。COPD患者行机械通气呼吸机相关肺炎(ventilatorassociated pneumonia VAP)的发病率和死亡率均较高。气管导管生物被膜感染是导致VAP的原因之一。 目的:本实验通过建立流感嗜血杆菌体外和慢性支气管炎大鼠体内及气管导管生物被膜模型,并给予不同浓度大环内酯类抗菌药(红霉素、罗红霉素、阿奇霉素)干预,探讨大环内酯类抗菌药对流感嗜血杆菌生物被膜的影响。 方法:通过结晶紫染色及扫描电镜鉴定体外建立流感嗜血杆菌生物被膜;通过结晶紫染色评价不同浓度大环内酯类抗菌药物对流感嗜血杆菌早期生物被膜形成的影响及对成熟生物被膜的破坏作用,以筛选出抑制作用好的药物;通过扫描电镜观察药物对生物被膜基本结构的破坏;通过菌落计数观察药物对生物被膜内细菌的抑制作用。通过熏烟结合脂多糖气道内滴入法建立慢性支气管炎大鼠模型;通过琼脂珠包被菌体气道滴入法建立慢性支气管炎大鼠流感嗜血杆菌急性感染模型;通过肺泡灌洗液、肺组织匀浆菌落计数及扫描电镜、病理切片观察慢支急性发作大鼠肺内生物被膜的形成;通过肺泡灌洗液、肺组织匀浆菌落计数和大鼠肺泡灌洗液及血清中TNF-α、IL-6、IL-8水平的变化,评价阿奇霉素灌胃治疗流感嗜血杆菌感染慢支大鼠的作用。并评价各炎性因子在慢支急性发作中的地位。采用慢性支气管炎大鼠气管置管,给予细菌气道滴入流感嗜血杆菌造成气管插管感染模型,并在扫描电镜下观察气管内导管生物被膜形成情况。通过气管导管菌落计数评价阿奇霉素在治疗气管导管生物被膜的作用。 结果:通过结晶紫染色及扫描电镜证实体外成功建立流感嗜血杆菌生物被膜;通过结晶紫染色观察到,流感嗜血杆菌在亚MIC浓度仍可形成生物被膜,大环内酯类抗茵药对生物被膜有一定抑制作用。其中在对早期生物被膜抑制作用的观察中,阿奇霉素组随药物浓度的增高形成的生物被膜的能力减弱,但同样为大环内酯类抗菌药物的罗红霉素和红霉素组,在1/8MIC浓度时形成生物被膜的能力较其它浓度为高(P<0.05),甚至高于无药对照组;在对成熟生物被膜破坏作用的结果显示,阿奇霉素组随药物浓度的升高对生物被膜的破坏力越强,并且,亚MIC的阿奇霉素对成熟生物被膜也显示出了一定的破坏作用。通过扫描电镜及菌落计数进一步观察阿奇霉素对生物被膜影响的结果显示阿奇霉素可破坏生物被膜的基本结构,使被膜表面粗糙、结构疏松,并且在1/8MIC-8MIC浓度可不同程度的抑制生物被膜内细菌数,但是在8MIC时仍未能彻底清除膜内细菌。慢性支气管炎模型组动物的气道组织病理学可见支气管黏膜上皮纤毛倒伏、脱落、管腔分泌物增多、炎细泡浸润、杯状细胞增生、平滑肌断裂。对照组气道黏膜上皮完整,纤毛无黏连、脱落,未见炎细胞浸润。对照组和慢支组大鼠肺泡灌洗液和肺组织匀浆细菌数在第一天时接种数均为10~7以上,病理显示对照组肺泡腔、气管旁及肺问质均出现大量炎细胞浸润,以中性粒细胞浸润为主,肺组织呈实变;慢支组肺泡腔及肺间质大量炎细胞浸润,炎细胞在淋巴细胞浸润的基础上出现中性粒细胞,且肺泡腔渗出明显,部分呈实变;提示急性感染模型成功建立。慢支组肺组织匀浆中细菌数显示在2周时最低,至一月时仍保持在10~2,且略有升高趋势。扫描电镜观察慢支感染大鼠肺组织内可见一外被膜样结构物质,内呈颗粒改变,结合光镜下可见肉芽肿内异物巨细胞包绕下被染成黑色颗粒状的菌体。阿奇霉素作用于慢支急性发作大鼠结果显示,肺泡灌洗液菌落计数中,给药组与慢支组相比细菌清除时间明显提前,在肺组织匀浆中慢支组及给药组一月时细菌仍未能彻底清除,但从细菌计数来看给药组较慢支组明显减少;病理显示给予阿奇霉素治疗后与未用药物干预组同期相比炎细胞浸润明显减少,肺泡腔渗出吸收;三种炎性因子数值给药组均较感染组明显降低。当肺泡灌洗液中细菌数高时三种细胞炎性因子水平均较高,并随细菌数减少,数值不同程度下降,且当肺组织内有细菌定植时,炎性因子水平高于对照组,低于感染组。给药组IL-6及IL-8肺泡灌洗液中数值在一周左右时低于对照组。扫描电镜可见导管上生长的生物被膜表面凹凸不平,并见大量胞外基质包被下的细长菌体,证实流感嗜血杆菌可在气管内导管形成生物被膜。阿奇霉素作用后,气管导管生物被膜内细菌数与未用药相比有所下降,但一月后与未用药相比无明显差异。 结论:流感嗜血杆菌可在体外形成生物被膜。流感嗜血杆菌在大环内酯类抗菌药(阿奇霉素、罗红霉素、红霉素)亚MIC浓度时可形成生物被膜。大环内酯类抗菌药对生物被膜有一定破坏作用,其中阿奇霉素作用最强。高浓度及亚MIC浓度阿奇霉素均可影响生物被膜黏附性、破坏生物被膜基本结构,并可减少膜内活菌数,但不能完全清除膜内细菌。本实验成功建立慢性支气管炎及慢性支气管炎流感嗜血杆菌急性感染大鼠模型并在慢性支气管炎大鼠体内可见生物被膜样物质。阿奇霉素对慢支流感嗜血杆菌生物被膜感染大鼠急性期及生物被膜内细菌均有较好治疗作用。细胞炎性因子可作为评价感染程度的指标。阿奇霉素有抑制大鼠IL-6及IL-8的作用。流感嗜血杆菌可在气道导管内形成生物被膜。阿奇霉素对流感嗜血杆菌气道内导管生物被膜有一定抑制作用。


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