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人肝细胞型体外生物人工肝支持系统的实验研究

刘鸿凌  
【摘要】: 各种原因导致的肝衰竭十分常见,内科综合治疗疗效差。人工肝支持系统是治疗肝衰竭的重要方法之一,以培养肝细胞为核心的生物人工肝可暂时替代肝脏功能,清除有害物质,补充生物活性物质。目前用于临床研究的肝细胞材料主要有猪肝细胞、从HepG2细胞获得的C3A细胞系。采用C3A细胞的ELAD生物人工肝临床研究显示对肝衰竭患者有一定疗效,但治疗过程中有出血、过敏、凝血等不良反应。为完善肝细胞的功能,本课题将人肝再生增强因子(hALR)应用于生物人工肝细胞材料中,构建体外生物人工肝支持系统(BLASS),以期增强肝细胞分泌肝再生增强因子的能力,提高生物人工肝的疗效。 1.pcDNA3.1(-)hALR重组质粒的构建及鉴定ALR是一种热稳定细胞因子,它能促进肝细胞增殖和肝脏再生、抑制NK细胞活性,对受损的肝细胞具有很强的保护作用。本试验从肝组织中提取RNA,RT-PCR扩增出hALR片段,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),构建重组质粒pcDNA3.1(-)hALR,经测序、双酶切等方法鉴定,符合应用要求。 2.hALR肝细胞系的建立及功能评价采用有限稀释法和利多卡因转化等方法筛选HepG2细胞,挑选出一株生长旺盛、有一定利多卡因代谢功能的细胞,然后转染重组质粒pcDNA3.1(-)hALR,经G418筛选,在体外培养50代后,进一步对其合成、代谢、解毒等功能评价。结果显示:该细胞系功能稳定,形态良好,生长旺盛,24h利多卡因转化率65%,安定转化率79.33%。间接免疫荧光实验证实hALR在肝细胞胞浆中大量存在。转染后的肝细胞生长速度、白蛋白合成能力等均较转染hALR之前肝细胞有所增强。培养72h后,肝细胞上清液中AFP可升高至118.0±56ng/ml。免疫斑点印迹法检测到其培养上清液中ALR蛋白水平升高。另外该肝细胞系可在体外大量、快速增殖,基本符合生物人工肝细胞材料的要求。 3.hALR肝细胞系的生物反应器培养用已建立的hALR肝细胞系为细胞材料,以费森尤斯公司的P2S血浆滤过器为中空纤维反应器,反应器中预先装入存活率95%以上、总量1×10~8个肝细胞。用管路连接蠕动泵、肝细胞培养液等,构建生物反应器体外培养系统,对肝细胞在反应器中的生长及功能进行评估。结果发现细胞形态保持完整,并有一定的合成白蛋白、甲胎蛋白、尿素氮等作用。培养72h后细胞数升至7.60×10~8,96h后为9.02×10~8,细胞存活率分别为92%和95%,在倒置显微镜及扫描电镜观察下可见细胞能较好粘附在中空纤维上。24h利多卡因转化率88.4%,细胞培养液的细菌和支原体检测均未发现异常。 4.离线型生物人工肝支持系统的构建及对肝衰竭患者血浆体外治疗的初步研究我们采用“离线”方法,在体外对血浆置换后废弃血浆进行胆红素吸附,然后采用血浆代替培养液,对生物反应器中hALR肝细胞进行培养,充分利用肝细胞的代谢、解毒和合成功能。结果显示:治疗前血浆TBil为332.22±22.54umol/L,胆红素吸附后TBil为295.6±128.7μmol/L(P<0.01),白蛋白、BUN、血糖等变化无显著性差异。离线生物人工肝治疗前血浆中TBil、AFP和白蛋白值分别是295.6±128.7μmol/L,21.2±17.5ng/ml和26.44±2.186g/L,经4~6h治疗后,上述指标分别为239.4±103.9μmol/L(P<0.05),102±62.8ng/ml(P<0.01)和32.44±2.29g/L(P<0.05)。结果提示本离线型生物人工肝支持系统具有降低胆红素,增加白蛋白、尿素、AFP的合成等作用。 本项目成功构建hALR重组质粒,筛选出表达hALR的肝细胞系,并构建生物反应器及离线式生物人工肝支持系统,对肝衰竭患者血浆进行研究。本研究可简化生物人工肝制备的难度和方法,减少血浆消耗,从而提高人工肝的质控和安全性,为生物人工肝在肝衰竭治疗中的广泛开展和应用开辟新的途径。


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