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N-乙酰半胱氨酸对铜绿假单胞菌生物被膜的抑制及与环丙沙星的协同作用

赵铁梅  
【摘要】: [目的]探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)对铜绿假单胞菌的抑菌作用、对铜绿假单胞菌生物被膜的抑制作用和机理及与环丙沙星在抑制生物被膜上的协同作用。 [方法]应用微量肉汤稀释法测定NAC、哌拉西林(PIP)、环丙沙星(CIP)、阿米卡星(AMK)对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC):应用棋盘法测定NAC与上述三种抗菌药物的联合抑菌效应。应用银染法、扫描电镜(SEM)和激光共聚焦显微镜(CLSM)观察NAC、CIP、NAC+CIP对铜绿假单胞菌PA01生物被膜形态学的影响,并应用COMSTAT软件对CLSM观察到的图片堆进行空间结构定量分析。应用结晶紫染色法定量分析NAC、CIP、NAC+CIP对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响及对成熟生物被膜的破坏作用。应用MTT法定量检测NAC、CIP及二者联合应用对铜绿假单胞菌生物被膜菌的杀菌作用。应用色氨酸法定量检测NAC对铜绿假单胞菌多糖蛋白复合物合成的影响。 [结果]83.3%(25/30)的铜绿假单胞菌可被40mg/ml以下的NAC抑制,对PIP、CIP、AMK的敏感率分别为80.0%、83.3%、80.0%。联合抑菌试验显示:NAC与PIP表现为协同(33.3%)和无相互作用(66.7%);NAC与CIP表现为协同(50.0%)和无相互作用(50.0%);NAC与AMK表现为拮抗(13.3%)和无相互作用(86.7%)。NAC单用对PA01成熟生物被膜的影响,快速银染、扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察到的结果一致:加用NAC(0.5-10mg/ml)后,随着NAC剂量的增加,细菌及细胞外黏液样物质逐渐减少,增加到10mg/ml时细菌及细胞外黏液样物质基本被清除。CIP(8MIC)与NhC联合应用后,与CIP(8MIC)单用相比,对细菌及细胞外黏液样物质抑制作用也随NAC剂量增加而增强,快速银染、扫描电镜观察到NAC增加到5mg/ml时细菌及细胞外黏液样物质基本被清除;激光共聚焦显微镜观察到NAC增加到2.5mg/ml即可以看到生物被膜基本清除。COMSTAT软件分析结果显示:随着NAC浓度增加,单位面积生物量、基质覆盖率、平均厚度、最大厚度、选定图像生物膜表面积逐渐减少,表面积和生物量比值、粗糙系数逐渐增加,同样显示NAC与CIP存在协同作用。结晶紫定量分析显示小剂量NAC对铜绿假单胞菌生物被膜的生成影响较小,对成熟生物被膜表现为破坏作用,随NAC剂量增大,破坏作用增强,尤以10mg/mlNAC破坏作用为显著,可以使生物被膜下降到原来的50%以下;对已生长3天、6天的铜绿假单胞菌生物被膜,8MIC的CIP合用不同浓度NAC后抑制作用较单用进一步下降,以NAC5mg/ml组作用明显,可分别下降至对照的38.9%±7.7%、39.0%±9.3%,为CIP单用的58.1%±4.9%、48.9%±11.4%;但各个菌株之间差异较大。NAC和CIP单用,分别在2.5mg/ml和2MIC时与对照相比对被膜下细菌的杀菌作用有统计学意义(P<0.01),NAC与CIP联合作用后NAC和CIP在0.5mg/ml和1/2MIC时即对被膜下细菌的杀菌作用有统计学意义;8MIC的CIP和2.5mg/mlNAC联合应用后,被膜下菌平均下降为对照的0.94%,与单用8MIC的CIP相比被膜下菌下降了96.8%,与单用2.5mg/mlNAC相比,被膜下菌下降了95.4%。对生物被膜多糖蛋白复合物(GLX),NAC同样有抑制作用,0.5mg/ml、1mg/ml的NAC可以使铜绿假单胞菌生物被膜GLX含量分别下降27.64%和44.59%。 [结论]10mg/ml以上的NAC对铜绿假单胞菌有一定抑菌作用,并与PIP、CIP存在一定协同抑菌作用。NAC对铜绿假单胞菌成熟生物被膜存在破坏作用,对被膜下菌有杀菌作用,并与CIP存在一定协同作用;对生物被膜GLX的合成有抑制作用。


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