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SIRT1通过调节氧化应激参与老年COPD大鼠心脏损伤的机制研究

胡亦新  
【摘要】: 目的:以老年COPD大鼠为模型观察COPD诱导心脏损伤的改变,研究SIRT1调控COPD诱导心脏氧化应激损伤的机制,探讨SIRT1激动剂白藜芦醇在老年COPD:大鼠心脏氧化应激损伤中的保护作用。 方法:动物实验1.3月龄及22月龄雄性SD大鼠,分为青年对照组(12只)、青年COPD组(12只)、老年对照组(12只)、老年COPD(11只)、老年COPD+白藜芦醇(Rrsveratrol, Res)组(12只)。两年龄组中的COPD组及COPD+Res组大鼠于实验第1、25天气管内注入脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS) 200μg/200μl,第2-24天、26-56天被动吸烟。老年COPD+Res组大鼠提前2天给与白藜芦醇25/mg/d灌药至实验结束。共8周。2.测量各组大鼠体重、左心室重量、心脏超声;漂浮导管测量右心室压(Right Ventricular Pressure, RVP)、肺动脉压(Pulmonary Arterial Pressure, PAP)及左心室舒张末压(Left Ventricular End Diastolic Pressure, LVEDP); HE染色观察心脏病理、Masson染色明确心肌间质胶原纤维增生情况,透射电镜检测心肌超微结构改变;试剂盒检测各组大鼠心肌丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)水平;免疫组化检测心肌8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2'-deoxyguanine,8-OHdG)的表达;末端脱氧核酸转移酶介导的d-UDP缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d-UDP nickendlabelling, TUNEL)法检测心肌细胞凋亡情况。Taqman探针荧光定量PCR检测各组大鼠心肌SIRT1的mRNA表达,Weston Blot检测大鼠心肌SIRT1和p-FOXO3a的蛋白表达。细胞实验1.H9C2细胞分为对照组(C组)、溶剂对照组(DMSO组)、香烟提取液(Cigarette Smoke Extract, CSE)刺激组(CSE组)、CSE+Res组、Res组。CSE干预组给予CSE25μg/ml干预3-72小时,Res用药组提前30分钟给予Res 20μmol/L, DMSO组给予与Res等量的DMSO。2.噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况;特异性荧光探针CM-H2DCFDA和荧光微量平板法检测ROS的表达;荧光分光光度计检测细胞线粒体膜电位,试剂盒检测各组细胞半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性;Taqman探针荧光定量PCR检测各组细胞SIRT1的mRNA表达,Weston Blot检测各组细胞SIRT1和p-FOXO3a的表达。 结果:第一部分1.青年、老年COPD模型的肺部病理改变符合COPD的特点。2.与老年对照组相比,老年COPD组心肌间质胶原纤维含量升高(P0.01)。左室舒张末径(Left Ventricular End-Diastolic Dimension, LVEDD)、LVEDP显著升高(P0.05),8-OHdG表达显著升高(P0.01),MDA增加(P0.01),SOD活性下降(P0.01)。 第二部分体内实验1.与老年对照组大鼠相比,老年COPD组大鼠SIRT1 mRNA、蛋白表达均降低(P0.05),p-FOXO3a蛋白表达降低(P0.05);心肌细胞凋亡数量增加(P0.05);2.与与老年COPD组大鼠相比,老年COPD+Res组大鼠SIRT1 mRNA.蛋白表达均升高(P0.05),p-FOXO3a蛋白表达升高(P0.05)。心肌间质胶原纤维含量下降(P0.01),LVEDD下降(P0.05)。8-OHdG的表达显著降低(P0.05),MDA水平降低(P0.05),SOD活性升高(P0.05);心肌细胞凋亡数量显著减少(P0.05)。体外实验1.与C组相比,CSE刺激组SIRT1mRNA及蛋白相对表达量、p-FOXO3a蛋白相对表达量均显著降低(P0.01);与CSE组相比,CSE+Res组SIRT1mRNA、蛋白相对表达量及p-FOXO3a蛋白相对表达量升高(P<0.05)。2.随CSE刺激浓度增加,H9C2产生ROS增加;提前给予Res后ROS产生减少(P<0.05)。3.与C组相比,CSE组ROS表达显著增强(P0.01),caspase-3活性显著增加(P0.01);CSE+Res组与CSE组相比,ROS表达减弱(P0.01);caspase-3活性显著降低(P0.01)。 第三部分体内实验老年COPD组线粒体结构严重破坏,嵴消失。老年COPD+Res组线粒体结构损伤减轻。体外实验随CSE刺激浓度增加,H9C2细胞的线粒体膜电位降低,提前给予Res可以使线粒体膜电位升高(P0.01)。 结论:1.老年COPD大鼠发生心室重塑加重、心功能受损,与氧化应激损伤有关;2.SIRT1通过影响心肌线粒体膜电位调节线粒体ROS的产生,可能是SIRT1参与COPD大鼠心脏氧化应激损伤的调控机制之一;3. SIRT1参与COPD大鼠心脏氧化应激损伤的调控机制可能还与p-FOXO3a表达改变有关,有待于进一步研究;4.白藜芦醇通过刺激SIRT1的表达减轻心脏氧化应激和凋亡,可在COPD大鼠心脏损伤中发挥保护作用。


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