选择性去细胞猪皮的研制与临床应用及其复合基因修饰细胞促进创面愈合的实验研究

【摘要】： 目的探讨一种保留表皮层结构,去除真皮层细胞,具有低抗原性的选择性去细胞猪皮(selectively decellularised porcine skin, SDPS)的制备方法,并验证其生物安全性。将SDPS与自体微粒皮复合移植用于修复大面积深度烧伤创面,通过临床观察,了解SDPS作为烧伤创面覆盖物的临床应用效果,探讨其替代冷冻异体皮的可行性。通过腺病毒介导构建VEGF基因修饰脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell, UCMSC),将SDPS与基因修饰细胞复合移植用于修复大鼠全层皮肤缺损创面,探讨其促进创面愈合的效果,为临床应用研究奠定实验基础。 方法1切取健康白色家猪的全层皮,采用戊二醛-胰酶-去污剂的方法制备SDPS,通过大体及组织学观察确定各环节试剂的浓度和作用时间。微生物学检测包括细菌、真菌及病毒检测。采用Instron拉力机测定极限抗拉强度和断裂拉伸应变率。采用高效液相色谱法,测定SDPS浸提液中戊二醛含量。采用MTT法检测SDPS浸提液对NCTC clone 929细胞增殖的影响,参考美国药典评价体外细胞毒性。通过家兔皮内注射SDPS浸提液,对其产生刺激反应的潜在性做出评价。取成年Wistar大鼠72只,随机分为SDPS、新鲜猪皮、大鼠异体皮3组,于大鼠背部皮下分别植入1cm×1cm皮片,并于术后第1、2、4、8、12、16周行大体观察和组织学观察,评价其生物相容性。 2临床应用经解放军总医院第一附属医院伦理委员会同意并批准,术前均经患者或家属知情同意。31例烧伤患者(男性18例,女性13例),年龄21～60岁,平均(37.29±11.33)岁,烧伤面积45%-99%,平均(65.51±17.43)%,于伤后4-6d行切(削)痂植皮术,其中一部分切(削)痂创面移植SDPS加自体微粒皮,其余创面移植液氮冻存的异体皮加自体微粒皮,采取上下或左右部位作自身对比,观察创面移植物排斥脱落时间,比较术后3周创面愈合率,比较术后3个月残余创面发生例数,并根据温哥华瘢痕量表对创面瘢痕情况进行评估。其中1例于术后12d、3个月时取创面组织行病理学观察。所有病例随访到术后1-2年,观察术区外观与功能恢复情况。 3 UCMSCs传代培养后,以腺病毒介导GFP基因进行体外转染,倒置荧光显微镜下观察细胞转染效果,流式细胞仪检测细胞转染效率,确定最佳病毒感染复数(multiplicities of infection,MOI)。通过腺病毒介导构建VEGF基因修饰UCMSCs,通过免疫荧光染色及Western blotting检测转染后UCMSCs表达VEGF蛋白的情况,RT-PCR检测VEGF基因mRNA的表达情况,ELISA检测培养液中VEGF浓度,MTT法评价转染对UCMSCs增殖的影响。 4取成年Wistar大鼠45只,以大鼠背部急性皮肤全层缺损创面为模型,移植同等大小面积的SDPS,其真皮面均匀粘附大鼠微粒皮,按SDPS下注射物不同分为3组(每组15只)：VEGF基因修饰UCMSCs移植组(A组)、UCMSCs移植组(B组)、PBS空白对照组(C组)。于术后7d、14d、21d、28d观察创面情况,观察并记录各组大鼠SDPS排斥与脱落时间,计算28d创面愈合率。于术后3d、7d、14d、28d切取移植区域组织,对术后7d、14d、28d标本行HE染色,对术后3d、7d、14d标本采用Western blotting检测VEGF的表达、免疫组化检测CD34的表达,并计算微血管密度(MVD),进行统计学分析。 结果1采用戊二醛-胰酶-去污剂制备的SDPS表皮层细胞完整,真皮内基本无细胞成分、皮肤附件及血管,胶原纤维排列规则。微生物学检测未检出病原微生物。极限抗拉强度为(8.80±0.03)Mpa,断裂拉伸应变率为(77.60±1.60)%。无戊二醛残留。细胞毒性判定为1级,符合国家医疗器械生物学评价标准。动物皮内注射SDPS浸提液后24h、48h的原发性刺激反应类型为轻度,96h为极轻微。皮下植入实验显示3组皮片植入大鼠皮下后均出现炎性反应,SDPS和大鼠异体皮炎性反应较弱,真皮层内逐渐有新生血管生成和纤维样组织长入,植入皮片均逐渐降解,新鲜猪皮炎性反应较强,持续时间长,植入皮片逐渐变硬,不易降解。 2临床资料显示,31例大面积深度烧伤患者切(削)痂创面移植的SDPS与异体皮于术后10d左右可在创基留存,表皮基本存在,基底转红,无明显渗出,随着自体微粒皮生长、成片,两种覆盖物逐渐脱落。SDPS与异体皮的排斥脱落时间分别为(17.5±3.3)d和(14.2±2.5)d(P0.05),术后3周创面愈合率分别为(70.16±23.15)%和(75.45±22.38)%(P0.05),术后3月残余创面发生例数分别为4例和5例(P0.05),术后3月瘢痕评分平均值分别为7.8±3.6和8.1±3.3(P0.05)。术后12d,两种覆盖物创面组织病理学观察均可见炎细胞浸润；术后3月均可见再生的表皮层,真皮层可见纤维细胞、小血管以及胶原成分,SDPS与异体皮移植术后皮肤形态学无明显差异。术后1-2年随访,31例患者SDPS移植区域与异体皮移植区域的外观和功能均无差异。 3腺病毒介导的GFP基因对于UCMSCs具有较高的转染效率,转染效率与MOI值具有量效关系,当MOI=100时,转染效率达95%。转染VEGF基因后2d,UCMSCs在蛋白和mRNA水平上均可有效表达VEGF,免疫荧光染色、Western blotting、RT-PCR显示转染组细胞明显表达VEGF,ELISA结果显示7d时达到表达高峰,13d后仍可检测到VEGF的表达。介导VEGF基因转染的腺病毒对UCMSCs的增殖没有明显影响。 4创面移植的SDPS脱落时间,A组比B组、C组延长(P0.01)。28d大鼠背部皮肤缺损创面愈合率,A组比B组、C组增高(P0.01),B组与C组两项指标之间的差异无统计学意义(P0.05)。移植后7d,掀起SDPS观察创面基底情况,A组血管增生较B组和C组明显。移植后的3d、7d、14d各时间点A组VEGF及CD34表达明显强于B组、C组,且7d、14d时的血管密度(micro vessel density, MVD)明显高于B组、C组(P0.01),而B组、C组之间无明显差异(P0.05)。 结论采用戊二醛-胰酶-去污剂制备的SDPS保留了表皮结构,去除了真皮层细胞,具有组织形态学优势,微生物学、理化性能及生物学检测验证了其安全性,符合医疗器械生物学评价标准。SDPS复合自体微粒皮移植修复深度烧伤创面的临床效果与异体皮复合微粒皮移植相当,可替代异体皮应用于覆盖大面积深度烧伤切(削)痂创面。UCMSCs是一种较理想的基因载体细胞,腺病毒介导VEGF基因可以有效转染UCMSCs,转染后VEGF基因可获得较高的表达水平。VEGF基因修饰UCMSCs与SDPS复合移植可促进创面早期血管化,缩短创面愈合时间,改善创面愈合质量。