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胃远端腺癌miRNA表达谱及miR-204调控机制的初步研究

张文辉  
【摘要】: 研究背景: 微小RNAs (micro RNAs, miRNAs)是一类长约21~25 nt的非编码单链RNA分子,广泛存在于动植物中。它通过与靶mRNA完全或不完全的互补配对,产生基因沉默、发挥负性调控基因表达的作用。研究发现,特定的miRNA在细胞增殖、分化、凋亡、基因调控及肿瘤的发生中扮演重要的角色。其在胃癌的发生、发展中起癌基因或者抑癌基因的作用,为胃癌的诊断、治疗和预后评估提供了新的工具。但迄今为止,真正确认功能的miRNA还微乎其微,而且其发挥作用的具体机制也有待进一步的研究以明确。已有报道,与胃远端腺癌相比,贲门腺癌不仅位置独特,发病机制也存在不同。 目的: 筛选胃远端腺癌中差异表达的miRNAs,观察其与临床病理因素的关系,并就其在胃癌发生、发展中的作用及其机制进行初步的研究。 方法: 1.取我科实验室液氮冻存的胃远端腺癌及配对正常组织进行HE染色,确认病理情况;采用Agilent人miRNA寡核苷酸基因芯片,对3对胃远端(体、窦)腺癌组织及配对正常组织进行检测,筛选胃远端腺癌差异表达的miRNAs. 2.选择特定miRNAs,在20例胃远端腺癌及配对正常组织中用实时荧光定量PCR进行验证,并观察其与患者年龄、肿瘤大小、分期、淋巴结转移等临床病理因素的关系;在得到确认差异表达的miRNAs后,同法观察其在17例贲门腺癌与胃远端腺癌之间表达是否存在差异、胃腺癌患者血清中的表达状况、人胃粘膜细胞系与人胃癌细胞系的表达状况。 3.选择特定miRNA转染人胃癌细胞系,运用MTS法、流式细胞术观察其对胃癌细胞增殖、凋亡的影响。 4.运用TargetScan等生物信息学方法,预测特定miRNA可能的靶基因。 结果: 1.通过对液氮冻存胃远端腺癌及配对正常组织的HE染色,确认了各自的病理状况;miRNAs芯片检测,发现共47条miRNAs在胃远端腺癌组织和配对正常组织中表达差异显著,上调的24条,下调的23条;在这些差异表达的miRNAs中,miR-204. miR-196b、miR-101、miR-107等27条首次报道于胃远端腺癌中; 2.选择3个高表达miRNAs:miR-18b、miR-93、miR-196b和2个低表达的miRNAs:miR-204、miR-375进行实时荧光定量PCR分析,显示在胃远端腺癌患者样本中,miR-196b、miR-204、miR-375的表达情况与芯片一致,但其与患者年龄、癌栓有无、肿瘤直径、分化程度、分期、淋巴结转移情况均没有关联;同时,miR-204水平在胃腺癌患者血清中显著升高,ROC曲线分析显示,血清miR-204水平对胃腺癌患者和健康对照的鉴别效能为0.844(95%CI:0.579-0.973,p=0.002),敏感性和特异性分别为100%和75%,最佳cut-off值为0.0343(2-△ct,相对于U6 snRNA);在贲门腺癌和胃远端腺癌中,miR-375表达均下调,而胃远端腺癌下调的更明显,两者有显著性差异。 3.转染成熟miR-204 mimics于人胃癌细胞系MGC-803、BGC-823.SGC-7901,发现不论是不同转染浓度,抑或是不同时间点,对肿瘤细胞的增殖、凋亡没有明显的影响。 4.生物信息学显示BCL-2, NR3C1, SOCS6等可能为miR-204的靶基因。 结论: 1.胃远端腺癌有其独特的miRNA表达谱; 2.验证的差异表达miRNAs与胃远端腺癌临床病理情况无明显相关;贲门腺癌与远端胃腺癌存在miRNA的表达差异;血清miR-204可能作为胃腺癌潜在的分子标志物。 3.过表达miR-204对胃癌细胞系的增殖和凋亡没有明显的影响。 4.预测BCL-2, NR3C1和SOCS6等可能为miR-204的靶基因。


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