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P311促进烧伤创面表皮干细胞迁移的实验研究

孙薇  
【摘要】:烧伤是以皮肤热力损伤为始发因素的特殊类型的创伤,创面问题是烧伤的根本问题,如何尽早有效修复封闭暴露的创面是烧伤治疗的根本任务。只有烧伤创面得到及时的封闭与修复,才能有效防止水电解质、营养物质的丢失以及病原微生物的入侵等各种并发症的发生。有关创面修复与愈合的研究较多,但至今创面修复与愈合机理仍不十分明确。研究表明,表皮干细胞(Epidermal Stem Cells, ESCs)在皮肤组织损伤自行修复过程中起着举足轻重的作用。浅度烧伤创面自行愈合主要依靠创面或创周残存的表皮干细胞增殖、分化、迁移至损伤部位,并最终发挥创面修复功能。研究发现,表皮干细胞主要存在于皮肤基底膜或毛囊外鞘隆突部等处,它通过表达整合素(整联蛋白,integrin)等粘附分子与皮肤内细胞及细胞外基质如胶原、层粘蛋白(laminin)、纤维蛋白(Fibrin)等结合,而锚定于特定微环境或称为壁龛(niche)的巢穴中。只有在某些外部因素作用下,它才能离开其固有巢穴,而仅有当ESCs离开其固有巢穴后才具有分裂增殖、迁移等功能。所以表皮干细胞的离巢迁移是其发挥其创面修复功能最关键的步骤。 我们的前期研究发现,在烧伤创面修复过程中形成的肉芽组织及早期瘢痕中,P311基因高表达;已有研究证实P311参与多种组织修复,提示P311可能在烧创伤创面修复过程中起着重要作用。有文献报道强制性高表达P311的胶质瘤细胞、肌成纤维细胞的迁移能力明显增强;我们前期试验结果提示P311可促进体外培养的HaCaT细胞迁移,因此推测P311可增强表皮干细胞迁移能力,进而促进烧伤创面愈合。 为了证实这一假设,我们首先用免疫组化方法,探索在动物模型中P311与烧伤创面修复及表皮干细胞迁移的关系;再设计并构建P311腺病毒表达载体,感染分离培养的表皮干细胞,在体外创伤模型中观察P311高表达后对表皮干细胞迁移功能的影响。 研究内容和方法: 1.在小鼠浅Ⅱ°烧伤创面中表皮干细胞表达P311的实验研究 1).小鼠浅Ⅱ°烧伤模型的制作: 使用YLS-Q5超级台式温控烫伤仪致伤C57BL/6小鼠。使用自重500g,底部面积2cm2恒温金属烫头垂直接触小鼠皮肤3s,筛选65℃和80℃两致伤温度。经HE染色观察烧伤皮肤组织学改变,确定小鼠浅Ⅱ°烧伤模型的制作条件。 2).免疫组化方法观察烧伤创面P311表达情况: 18只C57BL/6成年雄性小鼠随机分为6组,其中在5组小鼠背部制作浅Ⅱ°烧伤创面,伤后6h、12h、24h、48h、72h等不同时相点的创面与正常皮肤交界处取材。以未做烧伤处理的小鼠正常皮肤作为对照。取材后迅速4%多聚甲醛固定24小时,石蜡包埋,切片。免疫组织化学染色,镜下观察P311表达情况。 3).免疫组化方法观察烧伤创面新生表皮中,表皮干细胞的P311的表达情况: (1)采用新出生小鼠腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-21-deoxyuridine,BrdU)方法标记表皮干细胞,于标记7周后制作浅Ⅱ°烧伤创面。72h取材制作蜡块,组织连续切片4μm/张,分别使用的兔抗人P311多克隆抗体和小鼠抗BrdU单克隆抗体做免疫组化染色,对比连续切片中BrdU阳性细胞及P311阳性细胞位置关系。(2)上述组织块切片依次使用BrdU抗体和P311抗体进行免疫组化双重染色,经过氧化物酶和碱性磷酸酶标记,分别通过DAB和BCIP/NBT显色观察BrdU标记的表皮干细胞表达P311情况。 2.高表达P311对体外培养的表皮干细胞迁移的影响 1). P311腺病毒表达载体及空载体的构建,腺病毒的包装、扩增、纯化、滴度测定 以本实验室所构建质粒pDsRed-P311作为模板,PCR扩增P311基因,并与Myc标签序列连接;以不连接P311基因的Myc序列作为空载对照。二者分别连接至穿梭质粒pAdTrack,在感受态大肠杆菌BJ5183中与骨架质粒pAdEasy同源重组,经PCR技术及特异性酶切技术验证构建的载体。腺病毒载体在293细胞中包装、扩增,根据腺病毒纯化、脱盐、快速滴度测定试剂盒说明书进行相关操作。将腺病毒滴度调整一致为1×10~9IU/ml并用于体外实验研究。 2). P311在体外创伤模型中对表皮干细胞迁移的影响 应用快速粘附法分离培养表皮干细胞,将P2代表皮干细胞均匀接种至12孔板,每孔1×10~4个细胞。细胞融合至70%时,按病毒颗粒数:细胞数=100:1加入腺病毒感染细胞24h。继续培养至细胞生长融合90%时,加入抑制细胞增殖的丝裂霉素致终浓度4μg/ml,培养2h后,进行划痕操作。划痕后0h、12h、24h、36h、48h、72h显微镜下观察划痕处细胞迁移情况。每孔选择2处固定位置,每个时相点均在该处拍照,测量划痕宽度,计算细胞迁移距离。实验数据用均数±标准误(x±s)表示,每时相点组间使用独立样本t检验,以p0.05为两组之间具有显著性差异。 实验结果: 1.P311在小鼠浅Ⅱ°烧伤创面表达,浅Ⅱ°烧伤创面新生表皮细胞表达P311 1).确定小鼠浅Ⅱ°烧伤模型的制作条件: 根据HE染色结果得出:烧伤温度65℃时,创面的病理诊断为浅Ⅱ°烧伤;同条件下烧伤温度为80℃时,创面的病理诊断为深Ⅱ°或Ⅲ°烧伤。在后续实验中致伤C57BL/6小鼠制作浅Ⅱ°烧伤模型,选用YLS-Q5超级台式温控烫伤仪,致伤温度为65℃,致伤时间为3s,致伤压力为金属烫头自重。 2).小鼠浅Ⅱ°烧伤创面及创周不同时期P311表达量不同 正常皮肤结构完整,细胞排列整齐,P311免疫组化染色仅在皮脂腺部位有非特异性阳性信号,其他部位均未见P311表达。 皮肤经浅Ⅱ°烧伤后6h,创面表皮完全坏死,创面部位真皮中未受损毛囊以及新生表皮细胞中可见表达P311的细胞。P311在这些部位持续表达,强度随烧伤后时间增加而逐渐增强,直至烧伤后72h仍可见大量阳性细胞。创周区域烧伤后6h,表皮及毛囊细胞即少量表达P311,表达强度在12h达峰后逐渐回落,72h已降至正常皮肤水平。 3).在烧伤创面新生表皮中,表皮干细胞表达P311: 采用BrdU标记表皮干细胞方法,小鼠注射BrdU后饲养至7周,BrdU免疫组化结果可以检测到阳性细胞。(1)连续切片分别经BrdU及P311免疫组织化学染色后,发现新生表皮中存在BrdU阳性细胞及表达P311细胞,且二者定位基本一致。(2)免疫组化双重染色的方法也证实了这一结论。 2.高表达P311对体外培养的表皮干细胞迁移的影响 1).经PCR鉴定和酶切鉴定高表达P311基因的腺病毒载体及空载体构建正确。经包装、扩增、纯化后得到的腺病毒滴度为1×109IU/ml。 2). P311在体外创伤模型中对表皮干细胞迁移的影响 实验发现感染腺病毒pAdEasy-P311后,表皮干细胞迁移能力较感染等量pAdEasy-Myc显著增强,这种差异在划痕后各时相点均有表现,并且进行性增加。划痕后12h、24h、36h、48h和72h,P311组表皮干细胞迁移距离[(63.87±10.14μm),(113.30±17.50)μm,(195.12±27.39)μm,(430.38±64.64)μm,(618.60±46.28)μm]与对照组各时相点细胞迁移的距离[(24.56±4.91)μm,(45.92±8.35μ)m,(68.77±10.6)μm,(135.39±24.45)μm,(296.18±64.26)μm]相比差异显著,p0.01。 实验结论: 在体动物实验研究发现,在烧伤创面新生表皮中表达P311的细胞来源于表皮干细胞;体外实验证实强制表达P311可促进表皮干细胞的迁移。因此本实验研究提示P311可能在烧伤后表皮干细胞迁移、创面再上皮化中起着重要作用。


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