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早期应激对海马学习、记忆功能的作用和机制研究

顼红雨  
【摘要】:背景 早期应激与成年后行为的变化、对应激的生理响应的变化和对精神疾病的易感性有关。动物和人的研究都已证实脑在幼儿早期对应激尤其敏感。在此期间经历的应激事件可能会造成神经发育产生永久性的改变,而这些改变可能与成年时发生的精神疾病有关。母爱剥夺(maternal deprivation, MD)是一个已经建立的成熟的早期应激动物模型,并被应用于与精神疾病病理和致病因素相关的神经化学研究。即使在对大多数成年应激源都没有显著响应的低应激反应期(SHRP),持续的母爱剥夺也会产生十分不利的影响。海马的许多功能都可以被早期经历的恶性应激所改变。首先,海马参与HPA轴的负反馈调节。应激后造成的海马或穹窿的损伤可以导致HPA轴的基础调节功能恢复减慢。其次,海马是调节与焦虑相关的行为的重要结构。海马损伤的大鼠在行为测试中如对新环境的探索、社会接触等表现出较少的焦虑。再次,海马在空间导向学习能力方面发挥重要作用。海马的损伤就会对空间导向学习能力产生影响。早期经历母爱剥夺,异常的海马发育就可能导致上述情形的出现。 目前关于母爱剥夺对海马结构和功能的作用机制缺乏详尽细致的研究,因而在许多方面没有明确的结论。本研究在前期研究的基础上,特别考虑母爱剥夺的模式和实验动物性别等因素,从分子机制和神经行为学两个角度探讨母爱剥夺对海马的学习、记忆功能的作用和机制。 目的 1.观察母爱剥夺对雌雄大鼠海马神经发生的影响。 2.观察不同模式的母爱剥夺对雌雄大鼠海马的Glucocorticoids receptors,Calretnin和Calbindin D-28k蛋白表达的影响。 3.观察母爱剥夺对雌雄大鼠成年后对应激响应的影响。 方法 1)建立3种不同模式的SD大鼠的母爱剥夺模型:MD,在PND2-PND14(出生后第2天到第14天)期间,幼仔每日与母鼠分离3h(9:00-12:00);MD4,在PND4,幼仔与母亲分离24h(9:00-9:00);MD9,在PND9,幼仔与母亲分离24h(9:00-9:00)。2)比较MD组和CON组(对照组)雌雄大鼠在PND21的体重。3)比较MD组和CON组(对照组)雌雄大鼠在PND21的海马的神经发生情况。对大鼠脑组织的冰冻切片进行免疫荧光染色,用ki67估测海马齿状回的细胞的增殖,用Doublecortin估测海马齿状回未成熟的神经元数目。4)对MD组和CON组(对照组)雌雄大鼠在PND21进行旷场测验,比较它们的探索行为和自主活动性。5)采用western blot和QT-PCR比较MD组、MD4组、MD9组和CON组的雌雄大鼠在PND21的海马的糖皮质激素受体(GR)的水平。6)采用western blot和QT-PCR比较MD组、MD4组、MD9组和CON组的雌雄大鼠在PND21的海马的calretinin蛋白和其mRNA的表达水平。7)采用western blot和QT-PCR比较MD组、MD4组、MD9组和CON组的雌雄大鼠在PND21的海马的calbindin-D28k蛋白和其mRNA的表达水平。8)对MD组、MD4组、MD9组和CON组的雌雄大鼠在PND21进行高架十字迷宫测验,检测它们的焦虑状况。9)对MD组和CON组(对照组)雌雄大鼠在PND25进行Morris水迷宫测验,比较它们的学习、记忆能力。10)在PND35,采用western blot比较参加水迷宫测试的和未参加水迷宫测试的MD组和CON组的雌雄大鼠的海马的calretinin蛋白水平。11)在PND35,采用western blot比较参加水迷宫测试的和未参加水迷宫测试的MD组和CON组的雌雄大鼠的海马的calbindin-D28k蛋白水平。 结果 1.雌性大鼠和雄性大鼠在出生后第21天的体重并没有差别。不论是雄性大鼠还是雌性大鼠,MD组的体重都极其显著低于对照组的(p0.001)。 2.在PND21,雄性大鼠的DCX+细胞数目要显著高于雌性大鼠的(p0.001)。对雄性大鼠来说,MD组的DCX+细胞数目极其显著多于对照组的(p0.001)。对于雌性大鼠来说,MD组的DCX+细胞数目则极其显著低于对照组的(p0.001)。 3.在PND21,雄性大鼠和雌性大鼠的ki67+细胞数目没有显著差别(p0.05)。雄性大鼠的MD组的较对照组的海马的细胞增殖减少(p0.05)。而雌性大鼠的MD组和对照组之间的差别不具有统计学意义(p0.05)。 4.在旷场测试中,雄性大鼠的总运动和总运动时间都显著高于雌性大鼠的(p0.05)。对雄性大鼠来说,MD组的总运动距离和和总运动时间都显著低于对照组的(p0.05)。而雌性大鼠两组之间没有明显差别(p0.05)。 5.在PND21,雄性大鼠海马的CALR水平低于雌性大鼠的[F(1,47)=74.8, p 0.001]。Post hoc比较说明,MD组和MD9组的雄性大鼠的海马CALR表达显著高于对照组的,而MD4组的与对照组之间没有明显差别。MD组的雄性大鼠的海马的CALR比MD9组的丰富。与对照组相比,MD组、MD4组和MD9组的雌性大鼠的海马的CALR水平都显著增高。MD组的雌性大鼠的海马的CALR表达高于MD4组的,而MD4组的和MD9组的差别不具有统计学意义。 6.在PND21,雌性大鼠的海马的CALB水平显著高于雄性大鼠的[F(1,47)=75.67,p 0.001]。MD组的MD9组的雄性大鼠的海马的CALB表达都明显高于对照组的,而MD4组的则低于对照组的。同时我们观察到MD组的雄性大鼠的海马的CALB水平高于MD9组的。对雌性大鼠来说,MD组的海马的CALB表达显著高于对照组的。另外,MD4组的和MD9组的CALB表达明显降低,而MD9组的CALB水平最低。 7.在PND21,雌性大鼠海马的GR mRNA、CALR mRNA和CALB mRNA表达均显著高于雄性大鼠的。对于雄性大鼠来说,MD组和MD9组的GR mRNA、CALRmRNA和CALB mRNA水平明显高于对照组的,而MD4组和对照组之间没有差别。对于雌性大鼠来说,MD组、MD4组和MD9组的GR mRNA和CALR mRNA表达均显著高于对照组的,而MD9组和MD4组的CALB mRNA水平则低于对照组的。 8.在高架十字迷宫测试中,与雌性大鼠相比,雄性大鼠在5min的测试过程中伸展次数较多,而且在开臂上的停留时间较长。与对照组相比,MD组和MD9组的雄性大鼠花费较短的时间在开臂,并且站立次数、探头次和伸展次数都显著增加,但是MD4组的雄性大鼠与对照组之间的差别不具有统计学意义。MD组和MD9组的雌性大鼠比对照组的站立次数增多。但是MD组、MD4组、MD9组的雌性大鼠与对照组的其它参数间(开臂滞留时间、探头次数和伸展次数)的差别不明显。 9.在Morris水迷宫测试中,对照组的雌性大鼠在测试第一天的平均潜伏时间显著高于雄性大鼠的(p0.05),后4天没有明显差别。MD组的雌雄大鼠的平均潜伏时间没有显著差别(p0.05)。对于雄性大鼠来说,MD组的平均潜伏时间在测试的第一天显著高于对照组的(p0.05),在第5天极其显著高于对照组的(p0.01),其余3天没有明显差别(p0.05)。对于雌性大鼠来说,MD组的平均潜伏时间只在第5天极其显著高于对照组的(p0.01),而其余4天没有明显差别(p0.05)。 10.在PND35,雌性大鼠和雄性大鼠海马的CALR水平有显著差别(p0.05)。对于雄性大鼠来说:经历母爱剥夺和水迷宫测试的大鼠的海马的CALR水平显著低于只经历过母爱剥夺的大鼠的(p0.05);经历母爱剥夺和水迷宫测试的大鼠的海马的CALR水平显著低于没有经历任何应激的大鼠的(p0.05);经历母爱剥夺和水迷宫测试的大鼠的海马的CALR水平极其显著低于只经历水迷宫测试的大鼠的(p0.01)。对于雌性大鼠来说:只经历母爱剥夺的大鼠的海马的CALR水平显著高于没有经历任何应激的大鼠的(p0.05);经历母爱剥夺和水迷宫测试的大鼠的海马的CALR水平显著高于只经历过母爱剥夺的大鼠的(p0.05);经历母爱剥夺和水迷宫测试的大鼠的海马的CALR水平极其显著高于只经历水迷宫测试的大鼠的;经历母爱剥夺和水迷宫测试的大鼠的海马的CALR水平极其显著高于没有经历任何应激的大鼠的(p0.001)。 11.在PND35,雌性大鼠和雄性大鼠海马的CALB水平有极其显著的差别(p0.001)。对于雄性大鼠来说:只经历水迷宫测试的大鼠的海马的CALB水平极其显著高于没有经历任何应激的大鼠的(p0.001);只经历水迷宫测试的大鼠的海马的CALB水平极其显著高于只经历母爱剥夺的大鼠的(p0.001);只经历水迷宫测试的大鼠的海马的CALB水平极其显著高于经历母爱剥夺和水迷宫测试的大鼠的(p0.001);经历母爱剥夺和水迷宫测试的大鼠的海马的CALB水平极其显著低于没有经历任何应激的大鼠的(p0.001);经历母爱剥夺和水迷宫测试的大鼠的海马的CALB水平极其显著低于只经历母爱剥夺的大鼠的(p0.001)。对于雌性大鼠来说:只经历水迷宫测试的大鼠的海马的CALB水平极其显著高于没有经历任何应激的大鼠的(p0.01);经历母爱剥夺和水迷宫测试的大鼠的海马的CALB水平极其显著高于没有经历任何应激的大鼠的(p0.01);只经历母爱剥夺的大鼠的海马的CALB水平极其显著高于没有经历任何应激的大鼠的(p0.001)。 结论 1.大鼠在新生期经历母爱剥夺(每日3h,PND2-PND14),会影响成年后海马的神经发生及其功能,并且造成的结果与大鼠的性别有关。 2.不同模式的母爱剥夺对大鼠海马的GR、CALR和CALB的表达的作用不同,同时与大鼠的性别有关。 3.早期经历母爱剥夺会对成年后雌雄大鼠的海马的学习和记忆功能造成一定程度的损害,增加大鼠的焦虑性,降低它们的探索性。 4.早期经历母爱剥夺会令雌性大鼠对成年后再次遭受应激更为敏感,响应更为强烈,而雄性大鼠对于再次遭受应激表现则较为缓和。


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