肿瘤相关巨噬细胞促进胶质瘤干细胞侵袭及其机制研究

【摘要】：在成人原发性脑肿瘤中，恶性胶质瘤是较为常见的。由于恶性胶质瘤具有侵袭性强的特点，致使神经外科手术无法完全切除，而后续进行的放疗和化疗又难以彻底地消除残存肿瘤细胞，这些细胞最终引起肿瘤的复发，导致患者预后差，死亡率高。 近年来，肿瘤干细胞（cancer stem cells, CSCs）理论的提出，促使研究者重新审视恶性胶质瘤及其生物学特性。我室和同行的研究表明，恶性胶质瘤中存在胶质瘤干细胞（glioma stem cells, GSCs），这群细胞在胶质瘤中含量甚微，但却有很强的自我更新和多向分化能力，在肿瘤的发生、发展中都起着关键作用。研究这群细胞的生物学特性，对认识恶性胶质瘤侵袭性生长的特点具有重要意义。 已有研究证据表明炎症细胞参与肿瘤的发生发展。肿瘤的免疫微环境及其中浸润的各种免疫细胞参与了肿瘤发生演进的诸多方面，如血管生成、免疫抑制、侵袭转移等。在这些浸润免疫细胞中，肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages, TAMs）所占的比例较高，也是最为重要的一个亚群。然而，关于肿瘤免疫微环境及其中浸润的免疫细胞，如TAMs，对CSCs生物学特性的影响尚有待深入研究。 为探讨TAMs在GSCs侵袭性生长中的作用及其机制，本研究首先以CD133作为标志物，从原代胶质母细胞瘤标本和小鼠恶性胶质瘤细胞系GL261移植瘤中分离并鉴定了GSCs；进一步，我们从恶性胶质瘤动物模型中成功分离了浸润的TAMs，并对其表型进行了鉴定；然后，我们分别在恶性胶质瘤临床标本和动物模型中观察了TAMs与GSCs的空间分布特点，并检测了TAMs对GSCs侵袭的影响；最后，我们研究了TGF-β1信号通路及其受体，转化生长因子-β Ⅱ型受体（type Ⅱ TGF-β receptor，TGFBR2）在TAMs促进GSCs侵袭性生长中的作用并探索了其中可能的治疗干预靶点。 研究内容及主要结果和结论如下： 1.成功分离并鉴定恶性胶质瘤中的GSCs：①人原代恶性胶质瘤标本中CD133~+细胞的比例具有异质性特点。应用流式分析方法检测5例人原代恶性胶质瘤标本发现，其中CD133~+细胞比例分布在0.1%~14.6%之间。②移植瘤中CD133~+细胞的比例显著增高，并呈稳态。与体外培养的小鼠胶质瘤细胞系GL261相比，其移植瘤中CD133~+细胞的比例显著增高（1.83%±0.5%vs.0.68%±0.46%, p0.01）；而GL261细胞系移植瘤与分选所得CD133~+细胞所接种的移植瘤中，CD133~+细胞的比例差异不明显（1.83%±0.5%vs.2.05%±0.52%, p0.05）。③经过流式分选所得的CD133~+细胞的纯度可以达到80%以上，并且在无血清神经干细胞培养基中具有连续成球能力。④CD133~+细胞的平板克隆形成能力显著性强于CD133－细胞。⑤CD133~+细胞相比CD133－细胞，高表达干细胞相关转录因子Sox2及神经干细胞标志物nestin，低表达星形胶质细胞和少突胶质细胞的分化标志物GFAP和MBP。⑥CD133~+细胞具有多向分化能力，能诱导分化成表达GFAP、MBP或者β-tubulin Ⅲ的细胞。 ⅢCD133~+细胞相比CD133－细胞具有更强的成瘤能力，仅1×103个CD133~+细胞即可在对应的动物模型中成瘤，然而GL261细胞系移植瘤和两例人原代恶性胶质瘤标本来源的CD133－细胞分别需要1×104和5×105个才能成瘤。 2.发现恶性胶质瘤中浸润的TAMs呈促进肿瘤生长的M2表型：①TAMs是恶性胶质瘤浸润免疫细胞中的重要群体之一。流式分析显示，恶性胶质瘤细胞系GL261移植瘤中浸润的所有免疫细胞，即CD45+细胞群体，在总细胞所占的比例约9.3%±2.7%；而浸润的巨噬细胞，即CD11b+细胞群体，所占总细胞的比例可以达到6.8%±1.1%；此外，在人胶质母细胞瘤临床标本中，亦可以看到有大量CD68+细胞的分布，特别是在肿瘤侵袭的边缘区域。②应用流式分选的方法，从GL261细胞系移植瘤中可分离得到高纯度的CD11b+F4/80+细胞（94.6%），即TAMs；并且这群细胞在光镜下呈圆形或者卵圆形的典型巨噬细胞形态；激光共聚焦显微镜观察，可见到CD11b抗原表达于细胞膜表面。③从正常小鼠脾脏中分离得到与TAMs具有相同表型的正常CD11b+F4/80+巨噬细胞（macrophages，Mφ）。④在未给予任何处理，或者给予IL-4（20ng/ml）、LPS（100ng/ml）联合IFN-γ（20ng/ml）处理三种条件下，TAMs均表现为高分泌IL-10、TGF-β1等M2表型相关细胞因子，低表达IL-1β、IL-6、IL-12p40和TNF-α等M1表型相关细胞因子，说明TAMs是极化了的M2巨噬细胞。 3. GSCs在恶性胶质瘤的侵袭边缘区域的分布TAMs在该区域的分布密切相关；分离得到的TAMs具有促进CD133~+GSCs侵袭的作用，TGF-β1是其关键分子：①观察人恶性胶质母细胞瘤临床标本及小鼠恶性胶质瘤动物模型发现，在肿瘤侵袭的边缘区域，CD68+TAMs与CD133~+GSCs存在共分布的情况，并且TGF-β1的分布区域与CD68+TAMs的分布一致。②与TAMs共培养对CD133~+和CD133－胶质瘤细胞的迁移无明显影响（p0.05）。③与TAMs共培养可显著性增强CD133~+GSCs的侵袭能力（p0.01）,而CD133－细胞在与TAMs共培养后，其侵袭能力仅有略微升高（p0.05）。④在与TAMs的共培养体系中使用TGF-β1中和抗体后，TAMs促进GSCs侵袭的效应显著性地被抑制（p0.01），而TGF-β1中和抗体对CD133－细胞的侵袭无明显影响（p0.05）。⑤使用人重组TGF-β1预先处理两例人原代恶性胶质母细胞瘤来源的CD133~+细胞和CD133－细胞，可显著性地增强CD133~+GSCs的侵袭能力（p0.01），而TGF-β1预处理对CD133－细胞侵袭的影响较为微弱（p0.05）。 4. GSCs优势性高表达TGFBR2，该受体的活化促进GSCs分泌MMP-9，这在TAMs介导的GSCs侵袭过程中发挥重要作用：①应用Real-time PCR和Western Blot的方法检测发现，与CD133－细胞相比，CD133~+GSCs优势性高表达TGFBR2。②R eal-timePCR检测发现，与CD133－细胞相比，CD133~+GSCs表达更多的与侵袭密切相关的基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）。③与TAMs共培养，上调CD133~+GSCs中MMP-9的表达水平；在共培养体系中使用TGF-β1中和抗体，可减少TAMs促进MMP-9分泌的效果。④使用TGF-β1预处理，增加人恶性胶质母细胞瘤来源的CD133~+GSCs中MMP-9的表达水平。 5.干预TGF-β1信号通路和敲低TGFBR2均能显著性下调MMP-9的表达水平，并在体内外实验中抑制GSCs的侵袭性生长：①在共培养体系中预先使用SIS3（Smad3抑制剂）或者SB203580（MAPK/p38抑制剂）均可下调CD133~+GSCs中MMP-9的表达水平（p0.01），并抑制GSCs的侵袭（p0.01）。②应用shRNA干扰技术，可下调TGFBR2的表达（61%），进一步减少CD133~+GSCs中MMP-9的表达水平（p0.01）。③应用shRNA干扰技术下调TGFBR2表达后，CD133~+GSCs侵袭能力显著性下降（p0.01），而CD133－细胞的侵袭未有明显改变（p0.05）。④应用shRNA干扰技术下调TGFBR2表达后，与Mock对照组相比，CD133~+GSCs所形成的颅内原位移植瘤侵袭能力明显减弱，肿瘤侵袭边缘区域CD133~+GSCs的分布亦有显著性减少（p0.01）。 综上所述，本研究的主要结论为：肿瘤侵袭前沿区域TAMs的分布，与GSCs的侵袭性生长有密切的关系；发生M2极化的TAMs主要通过旁分泌TGF-β1来促进GSCs的侵袭性生长；GSCs优势性高表达TGF-β1受体TGFBR2，是TAMs发挥促进GSCs侵袭的重要介导分子；TGFBR2的活化，可以上调GSCs中MMP-9的表达水平，进而促进GSCs的侵袭；使用TGF-β1信号通路的特异性抑制剂或者下调TGFBR2的表达，均能有效的抑制GSCs的侵袭性生长。上述研究结果表明，以TGF-β1信号通路及其受体TGFBR2为治疗靶点，对遏制恶性胶质瘤的侵袭性生长具有重要意义。