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人脐血源间充质干细胞与其基质细胞对体外造血调控作用的比较研究

孙浩平  
【摘要】:人脐血源基质细胞(human umbilical cord blood derived stromal cells,hUCBDSCs)是我科从2001年开始,在多项国家自然科学基金资助下率先从人脐带血中分离培养出并已被国内外认可的一种基质细胞。 在对造血微环境功能的系列研究中发现,以hUCBDSCs为滋养层的体外扩增体系对人脐血CD34~+造血干细胞具有明显的扩增作用,体外与hUCBDSCs共培养扩增后的人脐血CD34~+造血干细胞集落形成能力明显增强;对促进巨核细胞集落形成单位(CFU-Mg)的形成具有明显优势。动物实验研究结果进一步显示,hUCBDSCs经尾静脉输注可迅速归巢至小鼠骨髓并能长期生存;在对裸鼠造血损伤修复的研究中,发现hUCBDSCs具有促进造血损伤修复的作用。在体外研究中发现hUCBDSCs对促进巨核细胞集落的形成作用比人骨髓基质细胞更加明显后,进一步在造血微环境损伤裸鼠模型中,植入巨核系Hel细胞和人脐血源基质细胞,发现人脐血源基质细胞在体内促进巨核系细胞增殖和修复造血微环境都要强于人骨髓源基质细胞。以上研究提示人脐血源基质细胞在促进造血方面较骨髓源基质细胞具有一定稳定性和一定优势,对造血微环境损伤具有修复作用。相对于骨髓而言,人脐带血来源广泛,获取方便,不受道德伦理限制。因此,人脐血源基质细胞的发现为临床上放/化疗、造血干细胞移植后或其它血液性疾病改善造血微环境和促进造血恢复带来了新前景。但是,人脐血源基质细胞对促进造血干细胞向红系、粒系、单核系、巨核系、淋巴系分化的具体作用究竟如何,还没有相关文献报道,需要进一步研究。 目前,在对基质细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的认识上,存在很大的争议,引起争议的主要原因是这两类细胞自身缺乏特定的分子标记。根据对人脐血源基质细胞的研究工作和认识,认为基质细胞和间充质干细胞是同一起源,不同发育阶段的两类细胞。这两类细胞在细胞生物学特性及其造血调控作用有无差异,有必要进行系统的比较研究。 据此,本课题拟通过比较人脐血源基质细胞和人脐血源间充质干细胞体外有关生物学特点及其对人脐血CD34~+造血干细胞的粘附率、迁移率;对人脐血CD34~+造血干细胞诱导分化作用等方面探讨来揭示人脐血源基质细胞和间充质干细胞体外支持、调控造血作用的特点,以丰富对人脐血源基质细胞和间充质干细胞的全面认识,为今后人脐血源基质细胞的临床科学应用提供理论和实验依据。 方法: (一)人脐血源间充质干细胞和人脐血源基质细胞的分离培养及其细胞生物学特性的比较 1.人脐血源间充质干细胞(hUCBDMSCs)和人脐血源基质细胞(hUCBDSCs)的体外分离培养。健康婴儿(足月胎龄)脐带血在4小时内经6%的明胶沉降红细胞后,用1.077g/l的Percoll淋巴细胞分离液,密度梯度离心获得单个核细胞(mononuclear cell,MNC)。所得单个核细胞分别在改良Dexter体系培养hUCBDSCs,在间充质干细胞专门培养基(mesenchymal stem cell medium, MSCM)培养hUCBDMSCs。 2.倒置显微镜下观察两类细胞的形态、贴壁、集落形成,细胞伸展及融合情况;采用CCK-8法和Transwell法分别检测两类细胞的体外增殖、粘附和对hUCB-MNCs迁移的影响;两类细胞周期及细胞表面抗原的流式检测(细胞表面抗原选择:Fn、Lm、CD45、CD29、CD44、CD34、Stro-1和CD106)。 3.两类细胞向成骨、成脂、成软骨细胞诱导分化的检测。用茜素红染色检测成骨情况,用油红染色检测成脂情况,用阿辛蓝染色检测成软骨情况。 (二)人脐血源间充质干细胞和人脐血源基质细胞体外调节造血干细胞作用的比较 1.分别以两种细胞为滋养层细胞,对人脐血单个核细胞短期共培养后,行半固体培养法比较CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM形成情况,未行共培养的造血干细胞为对照组。 2.用逆转录PCR和实时定量荧光PCR方法检测两类细胞中G-CSF、TPO、SCF、SDF-1和GM-CSF细胞因子基因的表达。 3.用ELISA法测定造血干细胞分别与两类细胞共培养0、7、14天不同时相点,上清液中G-CSF、TPO、SCF、SDF-1和GM-CSF细胞因子分泌变化情况。 4.将用免疫磁珠分离法所得的脐血CD34~+造血干细胞分别与hUCBDSCs和hUCBDMSCs共培养,用流式细胞仪于共培养第7、14天测定CD34~+造血干细胞分别向粒系、红系、巨核系和淋巴系分化的情况。粒系选用的细胞标记:CD14、CD15、CD33;红系选用的细胞标记:CD71;巨核系选用的细胞标记:CD41a;淋巴系选用的细胞标记:CD3、CD19。CD34~+造血干细胞变化的检测标记仍选用CD34。 结果: (一)人脐血源间充质干细胞和人脐血源基质细胞的分离培养及其细胞生物学特性的比较 1.人脐血源间充质干细胞(hUCBDMSCs)和人脐血源基质细胞(hUCBDSCs)的分离培养 所获得脐血体积50-100ml,平均每份84ml,脐血所含细胞数平均为2.3×10~9/ml,经密度梯度离心能分离出的单个核细胞数平均为7.0×10~5/ml。每份脐血均可培养出hUCBDSCs,约67%的脐血可培养出HUCBDMSCs。 2. hUCBDSCs和hUCBDMSCs镜下形态观察、细胞增殖、迁移、细胞周期及细胞表面抗原检测 脐血源单个核细胞在改良Dexter体系培养hUCBDSCs,3-4天后,粘附在瓶壁的细胞形态有圆形、三角形、纺锤形和不规则形,培养7天后贴壁细胞主要由巨核样、纤维样和小球样细胞组成。用同一放大倍数在不同视野分类和计数细胞,巨核样细胞约占48%,纤维样细胞约占44%,小球样细胞约占8%,细胞融合达80%需30多天。在培养过程中无集落形成,按1:2的比例传代,传代能力差,最多传到第3代。传代后细胞仍为异形性,随着传代增加,细胞伸展和融合都明显延迟。传代后前4天细胞处于静息期,4天后开始呈对数性生长,在第8天达到细胞增殖最高峰,随后增殖能力慢慢下降并进入一个平台期。 脐血源单个核细胞在MSCM培养基中培养hUCBDMSCs,在培养前7天,贴壁细胞形态以纺锤形、三角形和小球形多见,但培养10天后,一些纤维样/纺锤体样细胞逐渐长成浓密的集落,并开始快速生长,其它形态细胞逐渐消失,细胞形态趋于同一性,约28天细胞可长满培养瓶,可按1:3的比例传代,大约每5-7天传代1次,可连续快速扩增细胞12代,细胞形态同原代相同无变化。大约每1×10~8脐血单个核细胞可形成5个纤维样集落。传代后前2天细胞处于静息期,2天后开始呈对数性生长,在第4天达到细胞增殖最高峰,随后增殖能力下降并进入一个平台期。 Transwell法检测两类细胞对等量脐血源MNC的迁移,hUCBDMSCs组的膜下迁移细胞数:152±37,hUCBDSCs组的膜下迁移细胞数为237±22,经配对样本t检验p=0.03。 hUCBDMSCs细胞周期检测,G0/G1期占86.34%,S期占4.14%,G2+M期占9.61%。hUCBDSCs细胞周期检测:G0/G1期占76.18%, S期占9.87%,G2+M期占13.94%。 hUCBDSCs和hUCBDMSCs都表达Fn、 CD44和Stro-1,都不表达CD34。hUCBDMSCs表达Lm和CD29,但hUCBDSCs不表达。hUCBDSCs表达CD45和CD106,hUCBDMSCs不表达。 3.hUCBDSCs和hUCBDMSCs向成骨、成脂、成软骨细胞诱导分化的检测 hUCBDMSCs可成功诱导向成骨、成脂、成软骨分化,hUCBDSCs不能向成骨、成脂、成软骨诱导分化。 (二)人脐血源间充质干细胞和人脐血源基质细胞体外调节造血干细胞作用的比较 1.人脐血单个核细胞分别与hUCBDSCs和hUCBDMSCs短期共培养后,行半固体培养基培养比较CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM形成情况 人脐血单个核细胞分别与hUCBDSCs和hUCBDMSCs短期共培养5天后,以hUCBDSCs为滋养层共培养的造血干细胞形成CFU-GM数高于以hUCBDMSCs为滋养层组,p0.01。以hUCBDMSCs为滋养层共培养的造血干细胞形成CFU-GEMM数高于以hUCBDSCs为滋养层组,p0.05。CFU-E形成数二者无显著性差异。 2. hUCBDSCs和hUCBDMSCs中G-CSF、TPO、SCF、SDF-1和GM-CSF细胞因子基因的表达的PCR检测 hUCBDSCs表达G-CSF基因高于hUCBDMSCs,而hUCBDMSCs表达TPO、SCF、SDF-1和GM-CSF基因要高于hUCBDSCs的表达。 3.用ELISA法测定造血干细胞分别与两类细胞共培养0、7、14天不同时相点,上清液中G-CSF、TPO、SCF、SDF-1和GM-CSF细胞因子分泌变化 经ELISA检测,上清液中细胞因子G-CSF、TPO、SCF、SDF-1和GM-CSF呈动态的分泌变化。在培养的0天,hUCBDSCs组上清中G-CSF的含量高于hUCBDMSCs组,SCF含量低于hUCBDMSCs组。TPO、GM-CSF和SDF-1的含量两组相当无统计学意义,p0.05。两组都有细胞因子G-CSF、SCF、SDF-1在共培养第7天下降,在第14天上升的表现。TPO则在两组共培养14天中都表现为持续上升,在0天、7天和14天3个时相点,hUCBDSCs组的分泌量均高于hUCBDMSCs组。GM-CSF在hUCBDMSCs组表现为在第7天下降,在第14天上升;在hUCBDSCs组则表现为持续上升,且在后两个时相点的含量高于hUCBDMSCs组。 4.共培养后CD34~+造血干细胞分别向粒系、红系、巨核系和淋巴系定向分化的检测 经免疫磁珠分选CD34~+造血干细胞流式检测阳性率为90.2%,共培养7天后两组中CD34~+造血干细胞下降;两组中CD19、CD3和CD41a呈阴性表达,CD33、CD71和CD14呈阳性表达。CD15在hUCBDSCs组呈阳性表达,在hUCBDMSCs组呈阴性表达。CD14的表达hUCBDSCs组高于hUCBDMSCs组;CD33和CD71在两组的表达相当,无统计学意义,p0.05。在共培养第14天,CD34~+造血干细胞进一步下降;CD19和CD41a在两组的表达仍为阴性,CD15、CD3、CD33、CD71和CD14表达阳性;两组中CD33表达呈上升趋势,CD71呈下降趋势;在hUCBDSCs组CD15的表达虽为上升趋势,但此时分泌量低于hUCBDMSCs组;此时相点hUCBDSCs诱导CD34~+造血干细胞向CD33~+的髓系细胞和CD3~+的淋巴细胞分化要强于hUCBDMSCs;在此时相点,红系表达的CD71在两组都呈明显的下降。 结论: 1.脐带血经相同密度梯度离心所得的单个核细胞,用合适的培养基培养可成功获得hUCBDSCs和hUCBDMSCs,这两类细胞具有不同的细胞生物学特性,利用hUCBDMSCs具有较多的干细胞特性可以将两类细胞区别。 2. hUCBDSCs在体外早期促进CD34~+造血干细胞向髓系定向分化要优于hUCBDMSCs。hUCBDSCs在促进造血干细胞向巨核细胞分化和血小板生成方面比hUCBDMSCs具有更大的潜能。


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