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血小板活化表达P-选择素对原发性肺癌血行转移的影响及机制研究

宫亮  
【摘要】:原发性肺癌,简称肺癌(Lung cancer),目前已知是所有癌症中死亡的第一位,并且其发病率和死亡率仍逐年上升。远处血行转移是造成肺癌患者预后不佳的主要原因之一,研究肺癌血行转移的机制并进一步探讨可能的干预措施,对于肺癌患者的诊治具有积极的意义。 血行转移(Hematogenous metastasis)是一个复杂的多步骤,多因素干预的过程,包括肿瘤细胞从原发灶迁出、随血液运行到达靶器官部位并被血管内皮捕获和粘附、然后穿越内皮细胞和细胞外基质形成转移灶等多个步骤。近年来越来越多的研究提示,循环中的血小板活化(Platelet activation)对包括肺癌在内的多种恶性肿瘤的血行转移都存在重要影响,并有可能成为非常具有希望的新的治疗靶点。但是,血小板活化是如何影响肿瘤细胞的血行转移过程的,其具体机制目前尚不清楚。 血小板被激活时可以聚集在肿瘤细胞周围,与肿瘤细胞粘附并形成复合物,在此过程中,有很多种的生物活性物质和粘附分子参与。P-选择素(P-selectin)是一种重要的细胞粘附分子,主要存在于血小板的α颗粒内,静息时无表达或持续低表达,当血小板被激活后,通过膜融合作用, P-selectin可快速在血小板膜表面表达,因此常被作为血小板活化的标志。近年研究发现,P-selectin能够通过与多数肿瘤细胞如结肠癌,乳腺癌,恶性黑色素瘤,胃癌,淋巴瘤等表面的配体结合来影响肿瘤的转移活性,但是目前大多数肿瘤细胞表面的P-selectin配体还未完全鉴定,P-selectin与其配体的相互作用对肺癌的血行转移有何影响也未明确,值得进一步研究。 鉴于此,我们先对肺癌患者外周血中血小板活化和血小板P-selectin的表达情况进行了检测,并分析其与患者临床病理特征、血行转移以及预后之间的关系。然后检测了肺癌组织和肺癌细胞中P-selectin的配体P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)的表达,再以肺腺癌A549细胞为研究对象,构建PSGL-1-shRNA干扰载体,转染并建立抑制肺癌细胞PSGL-1表达的细胞株,从正、反两方面检测高、低不同血小板P-selectin表达状态、PSGL-1表达或抑制对血小板-肿瘤细胞复合物形成的影响,对肺癌细胞在血管内皮细胞表面滚动和粘附的影响,以及对肺癌细胞跨膜侵袭和能力的影响。最后进一步探讨了血小板P-selectin与其配体PSGL-1相互作用后,肺癌血行转移相关的整合素基因(α3、α5和β1)以及基质金属蛋白酶基因(MMP-2,MMP-9)的影响及其意义。通过以上研究,我们希望明确血小板活化表达的P-selectin在肺癌血行转移中的作用,并初步探讨P-selectin通过与其配体PSGL-1的结合影响肺癌血行转移的可能机制,研究将有助于为进一步深入明确肺癌血行转移的机理并进而寻找新的治疗途径奠定一定实验基础。 方法: (一)血小板活化表达P-selectin与肺癌患者临床病理特征及血行转移的关系研究 1.分析肺癌患者初次到院就诊时外周血血小板计数(Blood Platelet Count, BPC)与肺癌临床病理的相关性。 2.提取和纯化患者血小板,通过流式细胞仪方法进一步检测血小板活化表达的P-selectin水平(Platelet P-selectin Positive percentage,PPP),并分析其与肺癌的关系和发生远处血行转移的风险,相关性和影响因素分析分别采用Bivariate Correlations分析和Logistic Regression法。 3.通过Cox proportional hazard模型和Kaplan-Meier法,对病例进行随访分析,研究上述不同影响因素对患者生存率的影响。 (二)血小板活化表达P-selectin与其配体PSGL-1的相互作用对肺癌细胞粘附和侵袭能力的影响 1.分别采用激光共聚焦和western-blot方法检测不同类型肺癌组织和细胞PSGL-1的表达情况。 2.通过shRNA技术,构建PSGL-1-shRNA干扰质粒,转染并建立抑制肺癌细胞PSGL-1表达的细胞株。 3.体外共培养血小板和肺癌细胞,扫描电子显微镜观察血小板和肺癌细胞形成复合物的情况,并从正、反两方面分析高、低不同血小板P-selectin表达状态、PSGL-1表达或抑制对血小板-肿瘤细胞复合物形成的影响,采用平行平板流动腔方法分析其对肺癌细胞在血管内皮细胞表面滚动和粘附的影响,以及采用Transwell小室分析其对肺癌细胞跨膜侵袭和迁移能力的影响。 (三)血小板活化表达P-selectin与其配体PSGL-1的相互作用对肺癌血行转移相关基因的影响研究 1.各组不同干预因素的血小板和肺癌细胞共培养后,采用RT-PCR和western-blot方法,研究其对肺癌细胞整合素α3(Integrin α3)、α5(Integrin α5)和β1(Integrin β1)mRNA和蛋白的表达影响,并分析其临床意义。 2.各组不同干预因素的血小板和肺癌细胞共培养后,同上述方法采用RT-PCR和western-blot分析,研究其对肺癌细胞基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白的表达影响,并分析其临床意义。 主要实验结果: 1.在肺癌患者中存在循环中血小板计数(BPC)增高和血小板活化P-selectin水平(PPP)表达增加的现象,且在肺腺癌中更为明显,与对照组比较相差非常显著(p0.01)。 2.进一步研究表明,患者PPP水平与肺癌的血行转移之间存在明显的相关性(p0.05),且外周血血小板计数(BPC)、血小板活化表达P-selectin(PPP)显示为是患者血行转移相关独立的影响因素;在多因素分析中,肺癌患者PPP的高表达水平(≥44%)对低表达水平(44%)显示出对患者血行转移有较明显的风险(OR=3.696,95%CI,1.39-9.83, p 0.01)。 3.PPP高表达水平的肺癌患者,与PPP低表达水平的患者相比,其生存期明显减低(p 0.001),两者的生存曲线之间也存在显著的差异;进一步采用Cox proportionalhazard模型对随访患者进行多因素分析表明,PPP高表达水平是肺癌患者独立的预后危险因素(Hazard Ratio=5.98,95%CI,2.12-16.87,p=0.001)。 4.肺癌组织和体外培养的肺癌细胞中可检测到P-selectin配体PSGL-1的表达,且在肺腺癌组织中表达最强,鳞癌次之,但在小细胞肺癌中的表达则较少。 5.活化的血小板与人肺腺癌A549细胞共培养后可以形成血小板-肺癌细胞复合物,并且高、低不同的P-selectin表达水平之间存在明显差异;采用P-selectin的功能阻断抗体或者是通过shRNA方法抑制肺癌细胞PSGL-1的表达后,均能够明显抑制血小板-肺癌细胞复合物的形成。 6.活化血小板可以促进肺腺癌A549细胞在脐静脉内皮细胞表面的捕获和粘附,这种影响与血小板活化表达的P-selectin水平呈正相关,与对照组相比,细胞滚动速率下降60.9%(p 0.05),而细胞粘附的数目增加245.9%(p 0.01);而采用P-selectin的功能阻断抗体抑制其结合功能,或者通过shRNA方法抑制其配体PSGL-1的表达后,又都可以使肺癌细胞在内皮细胞表面的滚动和粘附明显减弱。 7.活化的血小板与人肺腺癌A549细胞共培养后,对肺腺癌细胞的跨膜侵袭能力也产生了影响;血小板活化表达P-selectin水平较高时,其与肺癌细胞相互作用后,肺癌细胞的跨膜侵袭数目与对照组相比,增加36.9%(p 0.01);而抑制P-selectin功能或者是通过shRNA方法抑制其配体PSGL-1的表达后,肺癌细胞的跨膜侵袭和迁移能力也受到明显的抑制。 8.血小板活化表达P-selectin水平较高时,其与肺腺癌A549细胞共培养后,不同程度的促进了肺癌细胞整合素α3和α5mRNA和蛋白的表达,并以α5的表达改变为最明显;而抑制血小板P-selectin功能或者是抑制肺癌细胞PSGL-1的表达后,这种血小板活化促进肺癌细胞整合素表达的作用也受到一定的抑制。 9.血小板活化表达P-selectin水平较高时,其与肺腺癌A549细胞共培养后,也不同程度的影响了肺癌细胞基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9mRNA和蛋白的表达,并以MMP-9的表达增高较为明显;而阻断血小板P-selectin与配体PSGL-1的相互作用,MMP-9的表达与未阻断组相比也明显减少。 结论: 1.循环中血小板计数和血小板P-selectin表达是与原发性肺癌特别是肺腺癌患者血行转移相关的独立的影响因素,而血小板P-selectin高表达水平也是肺癌患者独立的预后危险因素。 2.血小板P-selectin高表达时,可以诱导血小板和培养的肺腺癌细胞形成复合物,增强肺癌细胞在血管内皮细胞表面的捕获和粘附,并增强肺癌细胞跨膜侵袭的能力,从而可能进一步影响肺癌细胞血行转移的潜能。 3.血小板活化影响肺腺癌细胞血行转移的能力,与P-selectin和其配体PSGL-1的相互作用有关,当采用特异性的抗体抑制P-selectin的功能或者通过shRNA方法抑制肺癌细胞PSGL-1的表达后,活化血小板与肺癌细胞形成复合物的能力,肺癌细胞在内皮细胞捕获的能力,以及肺癌细胞跨膜侵袭的能力均受到明显抑制。 4.血小板活化表达的P-selectin与其配体PSGL-1相互作用后,通过促进肺腺癌细胞整合素α3和α5的表达增加,并同时增强血行转移相关基因MMP-9的表达,可能是其促进肺癌细胞在血管内皮细胞表面的牢固粘附,并继而促进肺癌细胞越过细胞外基质和基底膜实现远处转移的重要机制之一。


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