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线粒体转录因子A对肝外胆汁淤积肝细胞mtDNA氧化损伤的保护作用及机制研究

陈永标  
【摘要】:一、研究背景与目的 肝外胆汁淤积常由于一些恶性肿瘤、肝外胆管结石阻塞胆管或先天胆道闭锁导致胆汁流出受阻,胆汁积聚肝内,疏水性的胆汁酸引起肝细胞凋亡和坏死,最后可导致肝纤维化和肝硬化。对一些胆管阻塞时间长,黄疸程度深的患者,不仅手术耐受能力低,即使胆道梗阻解除了,术后肝功能仍然恢复慢,甚至出现肝功能进一步损害,造成临床治疗失败。 因此,胆汁淤积如何引起肝脏功能损害,一直是国内外学者关注的热点。氧化应激和线粒体功能障碍涉及到慢性肝脏胆汁淤积的发病机制,线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)对氧化应激高度敏感,极易发生氧化损伤。一旦mtDNA损伤超过某个阈值,mtDNA通过其编码的呼吸链亚基对氧化应激具有放大作用,这样会加重线粒体的氧化损伤直至细胞死亡。线粒体转录因子A(TFAM)具有结合和缠绕mtDNA及解螺旋能力,对维持mtDNA空间构想,调节mtDNA的复制和转录及损伤修复具有重要作用。基于以上研究背景,本课题拟研究肝外胆汁淤积患者肝损伤与肝mtDNA改变的关系,探讨线粒体转录因子A在肝外胆汁淤积中的表达及其对肝细胞mtDNA的保护作用,从而达到保护和改善胆汁淤积患者肝功能的目的。 二、材料与方法 1.病例标本与细胞系:严格按照入组条件选择12个梗阻性黄疸患者,其中胰腺癌6例,壶腹周围癌4例,胆管癌2例。10个非梗阻性黄疸患者为对照组,其中胰腺癌4例,胆囊结石6例。两组患者在年龄、性别上无统计学差异,所有病例排除病毒性肝炎感染、肝自身免疫性疾病或代谢性疾病;未用过有肝脏毒性的药物;有酒精肝患者也被排除。术中肝组织标本获取过程一致,排除肝门阻断对mtDNA的影响。切取的肝组织标本迅速浸泡于液氮罐中,并保存在-80℃冰箱中。人正常肝细胞株L02购于中国科学院上海细胞所。 2.HE染色观察病例标本肝脏组织病理变化;试剂盒检测氧化损伤指标MDA、8-OHdG改变及线粒体功能指标ATP含量的变化;实时荧光定量PCR检测mtDNA及mtDNA转录水平mtRNA改变;免疫组织荧光检测mtDNA氧化损伤指标8-OHdG的变化及mtDNA核样结构(anti-DNA)的改变。 3.甘氨酸鹅去氧胆酸(GCDCA)处理L02细胞模拟胆汁淤积体外模型,试剂盒检测LO2细胞线粒体氧化指标ROS、8-OHdG改变、细胞活性和线粒体膜电位、ATP含量的变化;实时荧光定量PCR检测mtDNA及mtDNA转录水平mtRNA改变;免疫组织荧光检测mtDNA氧化损伤指标8-OHdG的变化及mtDNA核样结构(PicoGreen)的改变。 4.用实时荧光定量PCR和western-blot检测肝外胆汁淤积患者及GCDCA处理L02细胞后TFAM mRNA和蛋白水平的变化。 5.利用重组质粒pEGFP-N1-TFAM、pEGFP-N1-ΔC-TFAM及pEGFP-N1对照,过表达TFAM或ΔC-TFAM后,观察其对GCDCA处理L02细胞mtDNA的拷贝数及转录水平mtRNA的影响;观察过表达TFAM或ΔC-TFAM后对肝细胞线粒体功能的改变;免疫组织荧光检测mtDNA氧化损伤指标8-OHdG的变化及mtDNA核样结构(PicoGreen)的改变。 三、结果 1.肝外胆汁淤积患者HE:肝索结构紊乱,肝细胞胞浆内胆色素沉积,肝细胞轮廓不清,肿胀,变性坏死,可见空泡样变;肝血窦扩张,胆小管扩张,内见胆汁淤积,小叶内见大量炎性细胞浸润。与对照组相比,肝外胆汁淤积患者MDA升高4倍,ATP生成减少37%,肝组织线粒体内8-OHdG定量检测升高9.9倍(p 0.01)。免疫荧光检测胆汁淤积患者肝细胞mtDNA均发现有明显的氧化损伤,而对照组未发现有氧化损伤。实时定量PCR显示胆汁淤积患者肝组织mtDNA拷贝数较对照组下降了60%(p 0.01),代表mtDNA编码基因转录水平COX1,ND1和ND6均有明显下降(p0.05),免疫荧光检测肝外胆汁淤积患者mtDNA核样结构明显减少。 2.GCDCA处理L02细胞后,随着GCDCA浓度增加,L02细胞线粒体氧化指标ROS含量、8-OHdG水平逐渐增加;肝细胞mtDNA拷贝数及转录水平mtRNA逐渐减少;线粒体功能(CCK-8、膜电位、ATP含量)下降。免疫细胞荧光显示随着GCDCA浓度增加肝细胞内8-OHdG含量逐渐增加而mtDNA核样结构逐渐减少。 3.实时定量荧光PCR显示肝外胆汁淤积患者TFAM mRNA表达较对照组明显减少,在GCDCA (50,75,100μM)处理L02细胞6小时后TFAM mRNA表达较对照组分别下降了27%,32%和60%(p 0.05);Western-blot结果显示,肝外胆汁淤积患者TFAM蛋白表达较对照组明显减少;与对照组相比,GCDCA25μM处理L02细胞6小时后,TFAM蛋白表达无明显变化,但随着GCDCA浓度加大(50,75,100μM),TFAM蛋白表达逐渐减少,100μM时达最低。 4.过表达TFAM后,GCDCA处理的L02细胞mtDNA拷贝数增加及转录水平恢复,肝细胞活力和线粒体功能(膜电位、ATP含量)得到改善。免疫细胞荧光显示肝细胞内8-OHdG含量逐渐下降而mtDNA核样结构逐渐增加。而过表达ΔC-TFAM,由于敲除了TFAM蛋白中具有转录活性的C末端,仅保留其维持mtDNA核样结构和维持拷贝数的功能,故其对肝细胞线粒体功能的改善程度较野生型差。 四、结论 1.肝mtDNA氧化损伤参与了肝外胆汁淤积患者肝细胞功能损害。 2.肝mtDNA损伤归因于线粒体转录因子A的缺失。 3.在胆汁淤积进程中,过表达TFAM能保护mtDNA以对抗胆汁酸引起的肝细胞毒作用。其作用机制在于TFAM在维持mtDNA结构和功能方面的复合作用。 4.过表达ΔC-TFAM也能保护mtDNA以对抗胆汁酸引起的肝细胞毒作用,但较野生型TFAM作用弱。


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