收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

抗人降钙素原特异性单克隆抗体的制备及其免疫传感器的初步研究

郑怡麟  
【摘要】:细菌感染导致的抗生素滥用致细菌耐药是我国乃至全球范围最突出的公共卫生问题之一,并且由其导致的脓毒血症也严重危害着人类健康,成为非心脏ICU死亡的主要原因。普通的细菌感染本身并不可怕,只要早期诊断明确并针对性治疗,不会造成严重后果。所以,细菌感染的早期诊断和鉴别诊断极为重要。临床常用传统感染诊断指标主要有外周白细胞计数(WBC)、血液中C反应蛋白(CRP)和血液细菌培养等,但都存在费时、误差大、灵敏度低、特异性差等缺点,因此,应用新的标志物来诊断细菌感染性疾病非常必要。降钙素原(PCT)是一种有116个氨基酸残基组成、分子量为13kDa的糖蛋白,血清降钙素的前体物。生理情况下,血中PCT浓度极低,基本检测不到,但在一些细菌感染性疾病,包括细菌感染引发的全身炎症反应、败血症或脓毒性休克等患者中血清PCT水平显著升高,并且和疾病严重程度呈正相关。因此,PCT可作为一种高灵敏的新的炎症检测指标。在临床中,血液中PCT的浓度变化应用于多种感染性疾病的诊断与鉴别诊断,可对感染性疾病进行感染程度的判断和治疗效果的评定,同时,可指导抗生素用药。PCT的便利、快速和准确测定为细菌性感染的诊断及治疗提供了新的可靠依据。目前PCT的主要测定方法包括定性(半定量)测定和定量测定两种方式。主流的诊断产品均为国外进口,价格昂贵。因此,研发具有自主知识产权、有较高灵敏度和特异性的PCT检测技术和相应产品,具有重要的社会和经济价值。 主要研究内容和结果: 1.重组PCT蛋白的原核表达与纯化 从GENBANK获得PCT编码基因及其他相关分子结构等基本信息,通过Graphicalcodon usage analyzer (http://guca.schoedl.del)分析密码子偏性并将基因序列5’端和3’端分别加入酶切位点及保护碱基后进行全基因合成。通过构建PCT原核表达载体,将PCT的DNA序列克隆入pET28a,再将重组质粒pET28a-PCT转化入大肠杆菌BL21(DE3),经1mmol/L IPTG诱导表达表达6h,得到融合蛋白,分子量约15kDa。15%SDS-PAGE鉴定表达蛋白破菌后在上清里,为可溶性表达。进行镍金属螯合层析纯化后鉴定,15%SDS-PAGE图谱显示几乎呈单一条带,分析结果显示其纯度可达90%以上。用Lowry氏法测得蛋白浓度为5mg/ml。纯化的重组蛋白PCT经特异性鉴定,即为目标蛋白,可用于免疫检测标准品及单克隆抗体制备的筛选。 2.抗人PCT单克隆抗体的制备鉴定及初步应用 依据在线软件预测,综合分析ChouFasman法预测蛋白结构β转角、KarplusSchulz法预测蛋白柔韧性、Emini法预测抗原表面的可及性、KolaskarTongaonkar法分析蛋白质抗原性、Bepipred法预测线性抗原表位、Parker法分析蛋白质疏水性等获得三段表位肽。人工合成3个肽段与BSA交联作为免疫原免疫Balb/c小鼠,细胞融合后通过复查及亚型分析保留7株抗体。采集小鼠单抗腹水经Protein A HP.F.F亲和纯化柱纯化,纯化后的抗体用间接ELISA法检测效价,均在1:64000以上,选出三株结合能力高、效果好的PCT单克隆抗体2-D7、2-H12、4-H12并对其抗体其他特性进行鉴定。最终选出特异性、效价和亲和力最好的单克隆抗体2-D7用Western blot和免疫组化进一步鉴定其特异性。由Western blot结果得出单克隆抗体2-D7能结合重组PCT抗原,与无关蛋白H-FABP不反应,表明其有好的特异性;免疫组化结果显示,2-D7能特异识别正常甲状腺及甲状腺癌组织中PCT蛋白,并初步鉴定PCT抗原在甲状腺癌组织有较高表达。 之后,用单克隆抗体2-D7作为包被抗体,酶标PCT抗体作为检测抗体,成功建立了重组蛋白PCT检测的ELISA体系。此免疫检测体系经过优化后,对60例细菌培养阳性血清和40例健康体检血清进行了检测,正常组PCT浓度为4.41±2.76ng/ml,感染组PCT浓度为35.70±15.03ng/ml,结果显示二者之间具有显著性差异(*P0.05),说明建立的配对抗体检测体系能够区分正常血清与感染血清之间的差异。再用本研究抗体检测体系与安图公司配对抗体对临床血清进行检测,本研究抗体检测阳性率为83.3%,而安图公司抗体阳性率为86.67%,所得结果表明我们的抗体检测水平已基本达到安图公司抗体检测水平。所得单克隆抗体为下一步PCT检测的研究提供了坚实的基础。 3.抗人PCT免疫传感器检测的初步研究 电化学发光免疫传感器由于其简便、快速、灵敏度高、选择性好等特点具有良好应用前景,尤其在临床检测方面得到越来越多的关注。我们首先将玻碳电极在L-Cys中电聚合在表面成膜,同时制备二抗生物偶合物GRA-Pd-PtNPs@anti-PCT-GOD,通过层层自组装修饰于电极表面,加入鲁米诺-H2O2共反应试剂,ECL信号显著增高,达到理论预期效果,成功制备了PCT夹心式电化学发光免疫传感器。对PCT免疫传感器各项性能进行了检测,结果表明免疫传感器各项性能良好。同时,模拟人体正常环境加入人血清进行PCT检测,结果证明该免疫传感器可以用于临床实际样品的检测。结果表明电化学发光免疫传感器对PCT的检测是可行的,为后续的新纳米材料的使用、新检测方法等的研究提供了新思路,也为进一步大样本检测研究、实现临床应用等奠定了基础。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 陈斌,府伟灵,黄庆,张晓兵,黄君富;压电免疫传感器微阵列检测铜绿假单胞菌的实验研究[J];中华医院感染学杂志;2005年04期
2 张波;府伟灵;毛琼国;姚春燕;陈鸣;徐世军;俞凡;;基于压电谐振检测技术的癌胚抗原免疫传感器的实验研究[J];生物医学工程学杂志;2006年04期
3 姚春艳;府伟灵;齐永志;;压电石英晶体免疫传感器[J];生命的化学;2006年02期
4 周焕英;高志贤;;免疫传感器在葡萄球菌肠毒素检测中的研究进展[J];中国卫生检验杂志;2007年01期
5 卢澄;高志贤;潘家荣;;压电免疫传感器研究进展[J];解放军预防医学杂志;2008年01期
6 高志贤;生物传感器研究进展及其在肉品检测中的应用[J];肉品卫生;1995年08期
7 郑纪山,高大林,周宗安;SPR免疫传感器及其应用[J];东南国防医药;1999年06期
8 聂雪梅,刘仲明,张水华;血清中丙肝病毒的压电免疫传感器检测[J];北京生物医学工程;2005年06期
9 彭图治,祝方猛,杨丽菊,程琼,唐婷,陈建勇;丝蛋白膜免疫传感器的研制及临床分析应用[J];应用科学学报;1999年01期
10 严枫;胡效亚;;免疫传感器在肿瘤标志物检测中的应用[J];分析测试学报;2006年02期
11 郭秋华;何小维;黄强;彭运平;;脂肪酸结合蛋白免疫检测技术研究进展[J];中国老年学杂志;2007年24期
12 范瑾瑾;电化学免疫传感器测定Ag-Ab反应[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;1995年04期
13 张波;压电石英晶体免疫传感器及其应用[J];国外医学.生物医学工程分册;2002年03期
14 欧海龙;夏成;张洪友;;纳米材料在免疫传感器中的应用[J];中国奶牛;2007年12期
15 林向华;刘仲明;;检测禽流感病毒的压电免疫芯片两种抗体固定方法的研究[J];检验医学;2010年12期
16 丁克祥,吴朝阳,郑永晨,王攀,周颖,曹国彬,胡燕祝,吕沅津;hTK1质量放大压电石英晶体免疫传感器研究[J];中国老年学杂志;2005年09期
17 徐英,谢三星;肉及其制品免疫检测技术进展[J];肉品卫生;1997年05期
18 王丹;廖伟娇;杜晶春;;免疫传感器载体上SPA法固定抗体的条件探讨[J];广州医药;2007年02期
19 覃柳;刘仲明;邹小勇;;纳米金固定酶标抗体的免疫传感器[J];医疗卫生装备;2007年06期
20 青宪;楚霞;;日本血吸虫抗体电化学免疫传感器研究[J];化学传感器;2008年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 徐爽;徐焱;;单克隆抗体在输血领域的应用探讨[A];中国输血1999年年会暨纪念ABO血型发现100周年学术交流论文专辑[C];1999年
2 李安民;;单克隆抗体标载的~(131)I治疗恶性脑胶质瘤Ⅱ期临床试验的三种给药途径的研究[A];第一届中国肿瘤靶向治疗技术大会论文集[C];2003年
3 于翠;施曼铃;王桂珍;吴建祥;周雪平;;几种重要植物病毒单克隆抗体的制备和快速检测方法的建立[A];第三次全国植物病毒和病毒防治学术研讨会论文集[C];2003年
4 刘振勇;邓国华;李呈军;张立春;田国彬;何后军;于康震;陈化兰;;抗禽流感H9N2亚型血凝素特异性单克隆抗体的制备与分析[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年
5 李振宇;赵益明;董宁征;沈飞;阮长耿;;抗FⅧ-C2区单克隆抗体的制备及鉴定[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年
6 张改连;黄烽;;抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体rituximab治疗类风湿关节炎的临床研究[A];第十二届全国风湿病学学术会议论文集[C];2007年
7 郝波;张国新;林艳;杨杨;王宏娣;;抗HCCR单克隆抗体的制备及其在肝癌检测中的初步应用[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(下册)[C];2007年
8 陶薇;杨连华;何卓晶;洪艳;陈勇;;抗戊型肝炎病毒重组蛋白单克隆抗体的制备和鉴定[A];浙江省医学会医学微生物与免疫学及医学病毒学学术年会论文汇编[C];2009年
9 马翠卿;郭奕阳;顾海燕;曾瑞红;杨丽娟;魏林;;一株抗A族链球菌表面蛋白Fba的单克隆抗体对应的表位与Fba结合调节蛋白FH的位点重叠[A];河北省免疫学会第六次免疫学大会资料汇编[C];2010年
10 王海军;袁若;柴雅琴;牛欢;曹娅玲;;基于双酶放大的过硫酸根的电致化学发光免疫传感器[A];中国化学会第十届全国发光分析学术研讨会论文集[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 蒋文;基于敏感电极界面及电活性纳米探针构建的高灵敏电流型免疫传感器的研究[D];西南大学;2011年
2 王明华;分子模拟辅助研究氨苄青霉素残留快速检测免疫传感器的特异性[D];浙江大学;2011年
3 易维京;心衰标志物NT-proBNP高效免疫传感器检测的关键技术研究[D];第三军医大学;2011年
4 肖飞;新型电化学免疫传感器的制备及其在食品安全检测中的应用研究[D];华东师范大学;2012年
5 仲召阳;多肿瘤标志物诊断模式的建立和新型电化学免疫传感器的研制[D];第三军医大学;2010年
6 杨娅;违禁/管制药品的免疫传感技术研究[D];苏州大学;2013年
7 唐琳;肝再生增强因子与肝癌发生、发展关系的研究[D];重庆医科大学;2005年
8 侯桂华;巨噬细胞移动抑制因子在同种移植排斥中作用及其机理的研究[D];山东大学;2004年
9 高勇;新型单克隆抗体荧光探针染料的合成及免疫荧光组织化学应用[D];西北大学;2006年
10 江敏;大鼠单克隆抗体的制备、鉴定、基因克隆、抗原分析以及药物偶联物的抗肿瘤作用研究[D];中国协和医科大学;1996年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 郑怡麟;抗人降钙素原特异性单克隆抗体的制备及其免疫传感器的初步研究[D];第三军医大学;2013年
2 魏治静;免标记的电化学免疫传感器的制备[D];青岛科技大学;2012年
3 杨霞;新型复合材料构建的电化学和电致化学发光免疫传感器的研究[D];西南大学;2010年
4 吕萍;纳米材料应用于电流型癌胚抗原和人绒毛促性腺激素免疫传感器的研究[D];西南大学;2011年
5 孙东艳;基于脂质体信号放大的电化学及电化学发光免疫传感器的研究[D];安徽师范大学;2011年
6 李青青;检测克百威农药残留的电流型免疫传感器制备方法的研究[D];山东理工大学;2012年
7 杜淑媛;克百威农药残留检测用无标记电流型免疫传感器的制备方法研究[D];山东理工大学;2012年
8 钟菲菲;基于免疫传感器测定2,4-二氯苯氧乙酸技术的研究[D];湖南农业大学;2010年
9 谭洪志;牛分支杆菌电化学免疫传感器的研究[D];西南大学;2011年
10 朱宇萍;基于无机纳米材料构建电流型甲胎蛋白免疫传感器的研究[D];西南大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 贾超时李德成;单克隆抗体产业研发项目将落户大庆[N];大庆日报;2008年
2 小许;市领导会见美国生物医药巨头[N];无锡日报;2010年
3 姜海;英科学家发现单克隆抗体[N];科技日报;2007年
4 本报特约撰稿人 李朝;单抗:生物医药发展的主旋律[N];医药经济报;2006年
5 记者 项铮;赛诺菲巴斯德研制抗狂犬病单克隆抗体[N];科技日报;2008年
6 记者 杨俊坚;单抗药物:站在同一起跑线[N];医药经济报;2011年
7 张蕾;治疗用单克隆抗体[N];光明日报;2002年
8 李晓;“苏州系列”单克隆抗体走向世界[N];苏州日报;2008年
9 张骁束;梅英;单克隆抗体的研究进展[N];中国医药报;2003年
10 邹平;单克隆抗体研究取得突破[N];医药经济报;2001年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978