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非标记型电化学适配体传感器的构建及其在蛋白质检测中的应用

邓昆  
【摘要】:蛋白质是生命的重要组成物质之一,也是整个生命活动的主要参与者。因此,蛋白质的检测特别是疾病状态下蛋白表达水平的检测将有助于我们更深入的了解生命的活动过程,对人类疾病的预防、诊断和治疗具有重要的现实意义。生物传感器是以生物分子作为识别元件(Recognition Element)的检测方法,因其具有高特异性、高灵敏度和操作便捷等特点成为目前最具有前景的蛋白质检测方法。抗体是目前应用最为广泛的生物分子识别元件,但是因其制备周期长、易失活、对检测环境要求较高等缺点,限制了其在生物传感器中的进一步发展。近年来越来越多的新型识别元素正在被引入到生物传感器的制备中,其中核酸适配体就是最为引人瞩目的一员。适配体是利用SELEX体外筛选技术从庞大的核酸分子文库中筛选获得的单链DNA或RNA,它们除了具有类似抗体的高亲和性结合与高特异性识别特性外,还表现出许多优于抗体的特性如分子量小、靶分子广泛、易于重复合成、易于标记、保存稳定且可以变性复性等,因此适配体正逐渐成为是一种新的理想的生物传感器识别元件。电化学生物传感器是一类通过生物分子识别元件将待测物质的浓度转变为可检测的电信号的检测传感器,其具有高灵敏度、不受溶液颜色影响,响应速度快、操作便捷、价格低廉、易于微型化等优点,将其与核酸适配体相结合,将成为继免疫电化学传感器和DNA电化学传感器后新的研究热点。 本课题的研究目的是建立一种高灵敏度、高特异性、操作便捷的蛋白质电化学适配体生物传感器。方式是将体外筛选得到的高特异性核酸适配体作为电化学生物传感器的分子识别元件,通过基于酶信号放大的设计策略,建立能够非标记地检测蛋白质的具有高灵敏度、高特异性的新型电化学适配体传感器,并将其应用于血小板生长因子及蛇毒种类鉴别检测的研究中。论文内容包括以下几部分: 第一章引言简要的介绍了核酸适配体的筛选原理、优越性及利用核酸适配体作为识别元件的方法学研究进展;详细的介绍了电化学传感器的原理及应用,以及基于酶信号放大的电化学适配体传感器的研究进展;着重论述了非标记电化学适配体传感器的设计策略和研究进展,并同时介绍了蛋白质检测的意义及方法学现状。 第二章基于酶放大设计策略的非标记电化学适配体传感器的构建近年来,许多氧化还原酶类的直接电子传递(DET)得到了较多的重视和应用。然而,由于固载基质的不稳定以及酶活性中心深埋在分子内,如果将酶分子直接固定到固体电极上,其DET是很难实现的。为了克服这一缺陷,有不少工作提出将酶固定于纳米材料修饰的电极表面,通过纳米材料的优点来实现酶的DET。其中,石墨烯(Gra)作为一种理想的材料,由于其优异的物理化学性能,如大的比表面积、好的导电性和易于功能化等,已经得到广泛的应用。另一方面,纳米金(GNPs)具有良好的生物相容性、强吸附能力和好的导电性,也被看作一种优良的纳米材料。这些性能也就使得PDDA保护的石墨烯-纳米金(P-Gra-GNPs)复合物成为更优异的固载基质,它不仅能加快活性中心与电极之间的DET,更为酶的固定提供了一个良好的微环境。由此本研究在二甲基二烯丙基氯化铵均聚物(PDDA)存在下,采用肼将氧化石墨烯还原,得到PDDA保护的还原石墨烯(P-Gra)。P-Gra表面带正电,通过静电吸附大量的纳米金(AuNPs),制得纳米金功能化的石墨烯复合物(P-Gra-AuNPs)。利用酶的催化特性来放大识别过程中产生的电化学信号。基于此,我们利用葡萄糖氧化酶(GOD)的直接电子传递(DET)首次构建了一种新型无试剂无媒介的电化学适体传感器,并用于对血小板源性生长因子(PDGF)的检测。 第三章基于电化学适配体传感器的血小板源性生长因子的检测血小板源性生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF)是一种低分子量促细胞分裂的肽类调节因子,因正常生理状态下存在于血小板的α颗粒内而得名,当血液凝固时由破裂的血小板释放出来并且被激活,具有刺激停滞于G0/G1期的成纤维细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞等进入分裂增殖周期的功能。血小板源性生长因子的检测在纤维化及癌症等疾病的诊断、预后评估中具有重要的临床意义。 我们利用血小板源性生长因子适配体构建了基于酶放大的电化学核酸适配体传感器,经过对电化学传感器修饰电极的表征,可以看到传感器的氧化还原峰电流减小值与待测PDGF浓度成正比。该适体传感器显示出良好的电化学响应,峰电流的减小值与浓度对数的增加值在0.005-60nM的范围内呈良好的线性,检测限为1.7pM。该传感器同样具有高的选择性,好的重现性和稳定性,也为其他基于适配体的蛋白检测提供了可行的依据。 第四章蛇毒种属特异性核酸适配体的筛选蛇伤的鉴别诊断需要准确的检测蛇毒的类型,目前蛇伤的实验室诊断主要依赖以蛇毒抗体的免疫学诊断方法,但是蛇毒抗体目前存在特异性差、毒性强依靠免疫动物制备困难等缺陷。受核酸适配体筛选原理(SELEX)中反筛原理的启发,我们通过在适配体经典筛选流程中引入多个鉴别靶标的反筛流程,来获取与目标靶标更高特异性结合的种属特异性适配体,我们将该技术称之为消减指数富集配体系统进化技术(Deplete systematic evolution of ligands byexponential enrichment, Deplete-SELEX)。我们在蛇毒种属特异性适配体筛选中引入了该方法,利用该技术筛选出用于鉴别中华眼镜蛇毒与国内常见的三种种毒蛇(尖吻蝮蛇、江浙蝮蛇、烙铁头)的中华眼镜蛇毒种属特异性核酸适配体,以利用于后续建立基于电化学适配体生物传感器的蛇伤现场快速检测方法的研究。 第五章基于电化学适配体传感器的蛇毒快速检测方法的研究目前蛇伤的诊断主要依靠临床症状(如伤口、局部体征等)、常规化验(血红蛋白、尿胆红素等)或捕获的蛇来确诊,但由于蛇伤早期临床症状往往不明显、不典型,且大多数的蛇伤发生在晚间或山林草地中很难看清蛇种,导致野外条件下蛇伤不能得到及时准确的诊断,无法正确指导抗蛇毒血清的使用以至延误抢救治疗良机。多年来,也有研究者应用免疫电泳、酶联免疫以及放射免疫等方法检测病人标本中各种毒蛇的种属特异性蛇毒成分,进行蛇伤免疫学鉴别诊断方法的研究,但这些方法的敏感度不够理想,阳性检出率受检材的种类、取材的时间、方法、诊断抗体的质量等因素影响较大。电化学适配体生物传感器因其检测速度快,灵敏度高,特异性强,简单便携成为蛇毒诊断与现场快速检测的理想检测手段。我们利用筛选得到的蛇毒种属特异性核酸适配体与电化学生物传感器相结合,构建了用于检测毒素的电化学适配体生物传感器,结果显示该传感器在毒素种属的鉴别检测中具有很好的特异性与灵敏度,可能成为蛇伤检测中的重要检测手段。 综上所述,我们采用GOD的直接电化学方法,成功构建了一个基于核酸适配体的高灵敏和高选择性的非标记电化学适配体传感器,用于对血小板生长因子及蛇毒特异性蛋白的检测研究。该传感器主要有以下优点:首先,P-Gra-GNPs复合物膜具有比表面积大和优良的生物相容性,它不仅能增加GOD的固载量,还能保持生物分子的活性,提高传感器的稳定性。其次,GNCs膜为PBA的固定提供了一个稳定和多孔的表面,进一步增强电化学信号。另外,双层GOD膜作为示踪剂带来更高的电流响应和高的灵敏度。基于以上的原因,该传感器显示出较低的检测限,满意的选择性,良好的稳定性和重现性。并且该方法也为其他蛋白质和生物标记物的检测提供了一定的参考。同时我们建立了适配体Deplete-SELEX筛选技术,并成功筛选到了中华眼镜蛇蛇毒种属特异性核酸适配体,成功构建了基于电化学适配体传感器的蛇毒快速检测新方法。


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