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肠缺血再灌注条件下IFN-γ通过调控HIF-1α在肠上皮屏障功能损害中的作用及机制研究

王文生  
【摘要】:背景与目的 肠粘膜屏障是机体抵御外界侵袭的的重要屏障。大量研究表明:战创伤、烧伤、大型手术等外科应激及炎性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)、全胃肠外营养(totalparenteral nutrition, TPN)等慢性病理刺激均可导致肠粘膜屏障损伤,造成肠源性感染,进一步加重原发疾病,诱发全身炎症反应综合征(SIRS),导致多脏器功能衰竭(MODs)[1]。尽管目前研究针对多种急、慢性病理条件下肠粘膜屏障功能调控机制做了大量研究工作,但不同病理条件下肠粘膜屏障损伤与修复机制仍未阐明。 近年来研究已经表明,肠粘膜局部缺氧可能是多种病理条件下肠粘膜屏障功能失衡的关键环节,现有研究已经证实在多种急、慢性病例刺激下,如:感染、脓毒血症、休克、手术及创伤等引起的缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤、炎性肠病等,均会引起肠粘膜的局部缺氧,而这种缺氧与肠粘膜独特的解剖结构密切相关。肠腔内一般氧含量低下,内含大量消化的食物、厌氧菌等,在肠粘膜屏障功能发挥中担负重要角色的肠上皮细胞层直接面对着肠腔的低氧环境,而在上皮细胞层之下是氧含量较为丰富的弥漫的网状血管,这样从肠腔、肠上皮、上皮下组织到粘膜血管逐渐形成了由低至高的氧浓度梯度,同时粘膜缺氧与炎症反应会协同作用,大量炎症因子会加剧缺氧造成的肠粘膜屏障功能损伤。随着研究的不断深入,缺氧激活的肠上皮间淋巴细胞(Intestinal Intraepithelial lymphocyte,IEL)分泌的γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)对肠粘膜屏障损伤发挥着关键作用。IFN-γ所致的肠粘膜屏障功能障碍被认为与其对肠上皮间紧密连接(tight junction,TJ)以及肠上皮细胞凋亡的影响密切相关[4]。 磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase, PI3K)是肌醇与磷脂酰肌醇(phosphatidyl-inositol, PI)的重要激酶,PI3K是细胞内重要的信号转导分子,参与调节细胞增殖、凋亡与分化等过程。但是对PI3K/Akt信号通路参与肠粘膜急性缺血再灌注I/R损伤的作用及机制并不清楚。 缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor1,HIF-1)是一种氧浓度依赖的转录调控因子,是促进机体对缺氧环境的适应的最重要的调节因子。有研究发现,PI3K/AKT通路与HIF-1α蛋白表达关系密切,但是对于其调控机制,以及该通路在IFN-γ调控肠粘膜屏障中的作用目前仍不明确,与HIF-1α氧依赖泛素化降解途径中关键酶PHD的关系也不明确。 因此本课题拟应用跨上皮电阻测定、蛋白印迹、激光共聚焦等技术,探讨I/R早期IFN-γ、HIF-1α、PI3K/AKT信号途径活化规律,以及对肠粘膜屏障功能维持起关键作用的紧密连接蛋白分子如Claudin-1、Occludin等的表达及结构的变化,并通过检测肠上皮跨上皮电阻TER,明确对肠粘膜屏障功能调控的作用。为阐明肠I/R损伤早期PI3K/AKT信号通路及HIF-1α在肠粘膜屏障功能调控中的作用机制,为肠粘膜屏障功能损害与修复机制提供理论依据。 方法 1.建立肠上皮细胞系Caco-2缺氧及IFN-γ干预模型,通过transwell小室细胞培养、跨上皮电阻(TER)测定技术,了解缺氧及IFN-γ干预情况下肠上皮细胞TER的变化情况。 2.建立小鼠肠道I/R损伤模型,通过蛋白印迹以及RT-PCR技术,测定小鼠肠粘膜中IFN-γ、HIF-1α、PI3K/AKT信号途径活化规律。 3.结合PI3K/AKT通路抑制剂LY294002,通过蛋白印迹及激光共聚焦技术,检测IFN-γ对肠上皮细胞Caco-2中的TJ蛋白表达及结构的影响,明确PI3K/AKT通路在IFN-γ调控肠上皮屏障功能中的作用及机制。 4.在上述体外模型中,通过蛋白印迹及激光共聚焦技术,检测IFN-γ对HIF-1α蛋白的影响以及脯氨酸羟化酶PHD的表达变化,利用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002,进一步探讨PI3K/AKT通路在IFN-γ调控肠上皮细胞HIF-1α含量中的作用及可能机制。 主要结果 1.I/R条件下肠粘膜HIF-1α蛋白含量明显升高,术后6h达到峰值;伴随着肠粘膜IFN-γ表达增多,PI3K/AKT信号通路活化增加; 2.缺氧引起了肠上皮细胞TER降低,而IFN-γ加剧了缺氧条件引起的肠上皮屏障功能损害; 3.单纯缺氧可以刺进体外培养肠上皮Caco-2细胞HIF-1α蛋白含量增加,并且入核增多,但是对HIF-1α mRNA水平影响较小; 4.外源性IFN-γ作用于培养的肠上皮Caco-2细胞,可以引起紧密连接蛋白Claudin-1和Occludin表达下降,并且紧密连接结构破坏,同时上皮细胞跨上皮电阻TER明显降低; 5.外源性IFN-γ作用于Caco-2细胞,可以促进PI3K表达及AKT蛋白磷酸化水平增加; PI3K/AKT通路抑制剂LY294002作用后可以抑制IFN-γ引起的上皮细胞紧密连接蛋白表达降低,促进跨上皮电阻TER恢复, 6.外源性IFN-γ作用于Caco-2细胞,可以引起HIF-1α蛋白含量增加,同时PHD1、PHD2表达减少;而LY294002预处理可以抑制IFN-γ作用引起的PHD2蛋白表达减少和HIF-1α蛋白含量增加; 结论 1、I/R条件下肠粘膜缺氧诱导因子HIF-1α蛋白含量明显增加;同时PI3K及AKT蛋白磷酸化水平增加,提示PI3K/AKT信号途径参与了HIF-1通路的调控; 2、I/R条件下肠粘膜IFN-γ表达升高,外源性IFN-γ作用于培养的肠上皮Caco-2细胞,可以引起紧密连接蛋白Claudin-1和Occludin表达下降,并且紧密连接结构破坏,同时上皮细胞跨上皮电阻TER明显降低。 3、外源性IFN-γ作用于Caco-2细胞,可以引起PI3K及AKT蛋白磷酸化水平增加,PI3K/AKT通路抑制剂LY294002作用后可以抑制IFN-γ引起的上皮细胞紧密连接蛋白表达降低,促进跨上皮电阻TER恢复,提示IFN-γ通过PI3K/AKT通路参与了对肠上皮细胞紧密连接蛋白表达的调控,从而影响肠上皮屏障功能。 4、外源性IFN-γ作用于Caco-2细胞,可以引起HIF-1α蛋白含量增加,同时PHD1、PHD2表达减少;而LY294002预处理可以抑制IFN-γ作用引起的PHD2蛋白表达减少和HIF-1α蛋白含量增加,提示PI3K/AKT通路参与IFN-γ对HIF-1α蛋白的调控,可能与抑制PHD2蛋白表达从而促进了PHD2相关的蛋白降解通路有关。


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