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鼻咽癌复发、转移相关血清miRNAs的筛选及鉴定

雷琳  
【摘要】:背景和目的: 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是在我国华南地区高发的头颈部恶性肿瘤,由于其对高能射线较敏感,加之鼻咽部解剖位置较隐蔽,放射治疗是分期较早患者的主要治疗手段,中晚期患者在此基础上还需行同步化疗[1],患者的5年总生存率约为70%[2],而5年的复发及远处转移率可达到30%-40%[3]。复发及远处转移是影响鼻咽癌患者生活质量及生存期长短的主要因素,而目前针对鼻咽癌复发与转移的肿瘤标志物检测大多存在局限性,相关检测的特异性通常较低、灵敏度也较差[4],因此迫切需要发掘特异性强、灵敏度高同时又易行动态观察的血清学检测指标以加大对鼻咽癌患者复发与转移的监测与早期干预。 MircoRNAs(miRNAs)是一类具有调控功能的单链非编码小分子RNA,长约18~25nt,主要通过与其靶mRNA分子的3'端非编码区(3'-UTR)结合发挥作用,在蛋白质翻译水平上特异性抑制目的基因表达,参与调控生物生长和发育等许多复杂的生命过程[5][6][7]。虽然目前miRNAs的生物学功能还尚未完全清楚,但可以肯定的是它们拥有相对特异的表达模式,同时参与调节生物的各种病理生理过程。异常的miRNAs表达与人类某些疾病相关,特别地,大量报道显示,miRNAs是参与结直肠癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、卵巢癌等常见肿瘤发生及进展的关键分子[8][9],因此,miRNAs被认为是一组新的具有癌或抑癌功能的基因,其具有特异性的表达谱[10]。值得强调的,循环中的游离miRNAs更具有相对稳定存在的特性且易于被检测等优势,可用于动态观察肿瘤状态及对患者临床疗效及预后进行评估,这使得循环中miRNA作为新的肿瘤标志物具有较好的临床应用前景[1][2][3]。 Ki-67作为细胞增殖状态的印记,其表达水平通常与癌症的临床病程相关[4]。血清Cyfra21-1作为细胞角蛋白1(9CK-19)的可溶性片段,在鳞癌中含量丰富[5]。血清SCCA也可作为多种鳞状细胞癌的血清学标记[6]。血清LDH与ALP作为临床生化常规检测指标,近年来也有与肿瘤发生发展相关的研究被开展[7][8],但血清miRNAs与上述肿瘤标志物联合检测被用于监测鼻咽癌复发远处转移的研究尚未见报道。 本研究拟应用miRCURY LNA microRNA Arrays芯片筛选不同预后的鼻咽癌患者放射治疗前后血清中差异表达的miRNAs,并用qRT-PCR(Taqman探针法)进行验证,同时检测鼻咽癌患者组织Ki-67表达情况,治疗后血清Cyfra21-1、SCCA、LDH、ALP含量,探讨血清miRNAs与上述肿瘤标志物联合检测与鼻咽癌患者出现复发远处转移的相关性,并寻找评估鼻咽癌预后生存时间的可能肿瘤标志物。 方法: 1.分别收集3例首次治疗结束后5年内出现复发远处转移的鼻咽癌患者及3例首次治疗结束后5年内未出现复发远处转移鼻咽癌患者治疗前后血清配对血清,应用miRCURY LNA microRNA Arrays芯片对血清miRNAs差异性表达谱筛查。 2.分别收集29例首次治疗结束后5年内出现复发远处转移的鼻咽癌患者及19例首次治疗结束后5年内未出现复发远处转移鼻咽癌患者治疗前后血清配对血清,应用qRT-PCR(Taqman探针法)对鼻咽癌差异性表达谱中差异性表达较明显的miRNAs进行验证。 3.分别收集上述29例首次治疗结束后5年内出现复发远处转移的鼻咽癌患者及19例首次治疗结束后5年内未出现复发远处转移鼻咽癌患者鼻咽癌组织石蜡块及治疗后血清,应用免疫组化法检测患者鼻咽癌组织Ki-67表达情况,化学发光法检测治疗后血清Cyfra21-1、SCCA含量,连续监测法检测治疗后血清LDH、ALP含量。 4.应用相关统计学软件分析上述指标与患者临床预后及其生存期间的关系。 结果: 1.miRNAs芯片结果显示,复发远处转移组较未复发远处转移组放疗前血清中miRPlusE1253表达上调,miR-22, miR-29a,miR-720, miR-665,miR-26b,miR-125b表达下调。复发远处转移组较未复发远处转移组放疗后血清中miRPlusE1072表达上调,miR-22,miR-29b,miR-143,miR491-3p,let-7c, miR-720,miR-550,miR-30c, miR-26b表达下调,其差异表达均在2倍以上。 2.qRT-PCR验证显示治疗前miR-26b,miR-29a,miR-125b及治疗后miR-29b,miR-143,的表达水平在复发远处转移组及未复发远处转移组间未见明显差异。 3.联合检测治疗前miR-29b、miR-125b及组织Ki-67可建立预判鼻咽癌患者复发远处转移最佳方程,该方程特异性及灵敏度分别为75.9%和78.9%,阳性预测值及阴性预测值分别为84.6%和68.1%。 4.COX回归分析示治疗前血清miR-29a及miR-125b为无进展生存期及总生存期的独立预后因素。 结论: 1.鼻咽癌患者治疗前血清miR-29a及miR-125b为无进展生存期及总生存期的独立预后因素。联合检测血清miR-29a及miR-125b可用于评估鼻咽癌患者不良预后生存期。 2.鼻咽癌患者治疗前血清miR-29b、miR-125b及组织Ki-67联合检测可用于预判鼻咽癌患者治疗后的复发或远处转移。


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