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金黄色葡萄球菌转座子突变文库构建与持留性突变株研究

姜北  
【摘要】:持留菌(persisters/persister cells)是存在于细菌群体中的一部分表型变异亚群,可以耐受致死浓度抗菌药物的作用而存活下来。由于持留菌的存在,抗菌药物的杀菌曲线常呈现出双相性,即初期由于正常细菌的大量死亡曲线呈现出快速下降趋势,后期由于持留菌的存在,曲线呈现出比较平缓稳定的趋势。持留菌不具有遗传稳定性,当存活下来的持留菌被再次接种到新鲜培养基后,细菌中仍只有一小亚群为持留菌,而细菌对抗菌药物的最低抑菌浓度无变化。持留菌与生物被膜形成及其相关感染具有密切关系,也是难治性慢性感染的重要凶手,其在抗感染治疗中的重要地位逐渐被认可,甚至有学者认为细菌持留性在临床上的重要性并不亚于细菌抗菌药物耐药性。 持留菌最初由Bigger于1944年在葡萄球菌的杀菌实验中发现,但长期以来持留菌的研究却以大肠埃希菌、铜绿假单胞菌及结核分枝杆菌为主。金黄色葡萄球菌(简称金葡菌; Staphylococcus aureus)是医院内感染和社区获得性感染的重要病原菌之一,既可引起皮肤、粘膜等处的轻型化脓性感染,也可导致菌血症、毒性休克综合征等危及患者生命的严重疾病。而耐药性的产生与广泛传播严重干扰着金葡菌的临床防治,使得近年来金葡菌感染逐步呈现发病率高、耐药性强、治疗困难、病死率高的态势。基于持留菌及金葡菌在临床感染性疾病中的重要地位,探寻金葡菌持留菌的形成机制对于有效控制金葡菌感染具有重要意义。 探寻持留菌的形成机制,关键在于分离鉴定与持留菌形成相关的基因。而文库筛选是鉴定持留相关基因的最常用方法。在既往研究中,已有学者通过建立大肠埃希菌或铜绿假单胞菌的转座子突变文库、定点突变文库及表达文库筛选得到了一些与细菌持留性相关的基因,这些基因的发现极大地促进了人们对持留菌的认识。基于以上考量,我们拟通过建立金葡菌转座子突变文库筛选鉴定金葡菌持留性相关基因,而文库的建立不仅可以用于筛选持留突变株,更可广泛用于其他研究。 为了规避文库筛选可能存在的不确定性,我们同时进行了金葡菌持留相关基因的定点研究。目前已知的持留性相关基因中,有很多与细菌的代谢活动相关,学术界目前普遍认为细菌的代谢活动与细菌持留性之间有着密切的关系。细菌的能量生成、氨基酸代谢、三磷酸甘油代谢、严谨反应等代谢活动的异常使得细菌进入非正常的生理状态,从而导致细菌持留菌的产生。基因glpD编码产物GlpD为三磷酸甘油脱氢酶,在细菌的代谢活动中具有重要作用,其很可能与细菌的持留性相关。glpD基因对E.coli持留性的作用已经有所研究,虽然可以肯定glpD在细菌持留水平的调节上发挥着某种作用,但具体是正性还是负性作用尚存争议。目前关于金葡菌glpD基因在持留性上的作用还无人涉足。为此,我们拟深入研究glpD基因在金葡菌持留菌形成中发挥的作用,以更好地揭示glpD基因与细菌持留性的关系,同时为探明金葡菌持留菌的形成机制提供借鉴。 本论文的第一部分我们利用转座子Tn917构建了金葡菌Newman株转座子突变文库,从该文库中得到了持留性突变菌株,对其进行了分析讨论;同时,我们以构建的转座子为工具,筛选得到了一株DAP耐药突变株。第二部分我们通过构建glpD敲除株及进行持留性对比实验,首次阐释了glpD基因在金葡菌持留菌形成中的作用。主要的研究内容和结果如下: 1.金黄色葡萄球菌转座子突变文库的构建与应用 (1)构建金葡菌Tn917转座子突变文库:将含有转座子Tn917的温敏穿梭质粒pID408先电转化入金葡菌RN4220,经其对质粒进行修饰后,再将质粒提取并电转化入金葡菌Newman株,通过高温及红霉素诱导转座子发生转座作用,从而得到含有大量转座子插入突变的文库。文库初步建立后,我们对文库质量进行了评价,文库子数量远足以满足实验需求,同时经鉴定文库子转座子插入随机性也较好,故文库的可应用性得到了保证。 (2)通过文库获得持留突变菌株,发现持留相关基因pyrD:在文库的评价鉴定过程中,我们发现了一株pyrD基因插入突变株(T18)。pyrD基因与细菌的呼吸作用及嘧啶合成代谢过程密切相关,鉴于持留菌与细菌代谢活动的密切关系,我们将该突变株作为持留性实验对象之一。同时由于嘧啶合成缺陷及呼吸链受损菌株在某些特殊情况下会产生小菌落变异等变化,从而影响细菌对抗菌药物的敏感性,故我们将T18株经环丙沙星作用后得到了其衍生株T18s。我们比较了野生株、T18、T18s株的24h和36h菌液的持留性,结果发现:①比较处于24h时间点的这三株细菌,24h的T18株活菌数量虽然相较野生株与T18s株偏少,但其经8h DAP作用后,剩余的活菌数量却是最多的,即T18株的持留性是最高的。而到了培养36h后,三株细菌的持留性对比关系发生了很大变化。②将培养36h的三株细菌的持留性与24h对应菌株的持留性进行比较,可见T18株的持留性显著降低,而T18s株的持留性并未产生显著变化,尤其值得注意的是,野生株的持留性升高了约103倍。③T18s株与野生株、T18株相比,其迟缓期明显延长,有文献认为细菌的这种生长特点与其持留性增加有密切的关系,但在本实验中,T18s株的持留性非但没有增加,反而有所降低。上述结果①②说明野生株、T18、T18s株之间存在持留性差异,而pyrD基因与金葡菌持留性相关,同时T18s株的某些基因变化在一定程度上补偿了T18株相较于野生株的持留性变化,但其具体的基因变化尚有待探讨。同时,野生株、T18株及T18s株的36h菌液相较于24h菌液的持留性分别呈现出了升高、降低、不变三种情况,这为后续实验分析持留性产生差异的原因提供了很好的素材。而结果③则提示我们,细菌生长迟缓期的长短与细菌持留性之间的具体关系尚有待进一步探讨。 (3)由文库筛选得到DAP耐药突变株,且耐药性的产生与acuAC转录单位相关:经过转座子插入位点测定,我们筛选得到的DAP耐药突变株转座子插入位点位于acuAC转录单位启动子的-35区,提示该转录单位破坏导致了DAP耐药性产生,而进一步的RT-PCR结果显示,该突变株中AcuA和AcuC的表达水平均明显低于野生株。acuAC转录单位引起DAP耐药的具体机制尚有待进一步探讨,后续的研究可能解释DAP耐药的新机制,甚至扩展出DAP耐药研究的新方向。 2.金葡菌glpD基因与金葡菌持留性关系研究 (1) glpD与细菌持留性关系的研究现状:glpD基因是与细菌代谢活动密切相关的基因,而过往在大肠埃希菌中,关于glpD对持留菌形成具有正性或负性调节作用的观点尚存争议,我们选择在金葡菌中对这一问题做进一步探讨。 (2)构建金葡菌glpD敲除突变株:以pYT3质粒为骨架构建敲除质粒,将目的基因左右臂及氯霉素抗性基因cat克隆入敲除质粒,将敲除质粒电转化入金葡菌Newman株,利用同源重组原理以敲除质粒的cat基因替换基因组上的目的基因glpD,从而实现glpD基因的敲除。随后采用多重引物PCR对敲除株的正确性进行了验证。 (3) glpD基因缺失对金葡菌持留性的影响:由于对数期和稳定期细菌持留菌比例大不相同,故其持留性也有很大差异,所以我们分别在细菌生长的对数期和稳定期进行持留性实验。为了选择最适宜的实验用抗菌药物,我们应用了多种类别的抗菌药物进行了预实验。最后发现,对于对数期持留菌实验,以环丙沙星、万古霉素进行实验时,可以获得较稳定的实验结果且各实验组别间差异也较为显著。而对于稳定期持留菌实验,只有达托霉素可以实现对稳定期金葡菌较好的杀菌效果,其他抗菌药物杀菌效力较低,不便于实验结果的比较。故最终我们选定了环丙沙星、万古霉素进行对数期持留菌实验,选定达托霉素进行稳定期持留菌实验。在对数期持留性实验中,我们发现以20MIC环丙沙星作用于菌液8h,glpD敲除株的持留性较野生株增加了约10倍;以20MIC万古霉素作用8h,glpD敲除株的持留性较野生株增加了约20-40倍,而以100MIC万古霉素作用8h,二者的持留性差异更显著,glpD敲除株的持留性较野生株增加了约40-100倍。在稳定期持留性实验中,我们以100MIC达托霉素作用于稳定期野生株和glpD敲除株8h,结果发现glpD敲除株的持留性较野生株下降了近1000倍。我们的实验表明,金葡菌glpD基因的缺失在细菌生长的对数期增加了细菌的持留性,而在稳定期反而降低了细菌的持留性,且降低的幅度较大。 综上所述,我们成功构建了金葡菌Newman株Tn917转座子插入突变文库,并证实文库具有良好的应用价值。从构建的文库中,我们筛选到了持留性突变菌株,并首次发现pyrD基因与金葡菌持留性相关。同时我们还利用该文库筛选到一株达托霉素耐药突变株,并发现其耐药机制可能与acuAC转录单位相关,可能是达托霉素耐药的一种新机制,也表明文库的建立不仅可以用于筛选持留突变株,更可广泛用于其他研究。另一方面,我们通过构建glpD敲除株首次阐释了glpD基因对于金葡菌持留性的作用,实验结果显示glpD基因在对数期降低金葡菌的持留性,而在稳定期增强金葡菌的持留性。一个基因可以在细菌生长的对数期和稳定期呈现出相反的持留性调节作用,这是首次发现。以上研究结果拓展了我们对金葡菌持留菌的认识与理解。


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