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MiRNA-300对结直肠癌肿瘤侵袭和增殖的影响及其调控机制的初步研究

王林  
【摘要】:背景及目的结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是人体非常常见的恶性肿瘤,其中又分为结肠癌和直肠癌。结直肠癌根据发病部位其发病率有很大的不同,从高到低依次为直肠、乙状结肠、盲肠、升结肠、降结肠及横结肠,近年有向近端(右半结肠)发展的趋势【1】。其发病与生活方式、遗传、大肠腺瘤等各方面关系密切。近几年研究发现,除了少部分结直肠癌患者有着明显的家族性发病倾向以外,绝大多数的患者属于散发性结直肠癌患者,发病的原因多与个体基因突变有关,其中包括有染色体突变、DNA错配修复等等不同的类型【2】,目前关于结直肠癌的发病机制研究并没有十分透彻,其发病途径大体可分为三类,但其中每种途径的具体分子机制还有待进一步的研究。除了原发病灶以外,结直肠癌的浸润转移也是危害人体健康的重要因素。结直肠癌最常见的浸润形式是局部侵犯,肿瘤通过种植转移逐步浸润周围组织或器官,造成相应的临床症状【3】。患者一旦出现肛门失禁、下腹及腰骶部持续疼痛,则是直肠癌侵及骶神经丛所致【4】。肿瘤细胞种植转移到腹腔、盆腔,形成相应的症状和体征,直肠指检可在膀胱直肠窝或子宫直肠窝内扪及块物,肿瘤在腹盆腔内广泛种植转移,形成腹腔积液【5】。结直肠癌的远处转移主要有两种方式:淋巴转移和血行转移。肿瘤细胞通过淋巴管转移至淋巴结,也可通过血行转移至肝脏、肺部、骨等部位【6】。目前来讲,结直肠癌最常见的远处转移是结直肠癌肝转移,这也是危害最大的途径,约50%的患者会出现术前或者术后的结直肠癌肝转移,其中,又有30%的病人在手术前已经有B超或者CT无法检测到的隐匿性肝转移。结直肠癌肝转移灶采取切除术是比较安全的,也是目前提高已经发生结直肠癌肝转移的患者的最优治疗方案,但遗憾的是,只有10%-20%的结直肠癌肝转移患者适合手术切除治疗,且其中70%的病人会出现病后复发。作为一种多基因突变导致的恶性癌症,结直肠癌有着非常复杂的发病机制,目前为止,人们已经发现有几种信号转导通路与结直肠癌的发生发展有着极其密切的联系,其中包括Wnt/β-catenin途径、Ras途径、p53途径等等,而在这些途径中,p53途径作为最经典的抑癌基因,被人们研究的也最多,但是经临床研究发现,那些因为p53变异而导致结直肠癌的患者对于目前的治疗手段有着明显的抵抗力,而且即使通过相应治疗得到好转,其预后也相对较差。虽然其机制还并不是十分清楚,但是并不妨碍人们将p53作为试图研究结直肠癌的突破口【7】。所有肿瘤组织细胞中,p53异常的数量超过了50%,在最初的发现中,p53是作为一个抑癌基因所出现,在细胞增殖生长周期中,p53起着极其重要的调控作用,它可以暂时性的暂停细胞周期的进程,以给与损伤dna修复的时间,也可以诱导细胞凋亡,防止细胞无限制增长现象的出现,还可以永久的终结一些不停进行细胞分裂的癌变细胞。可以了解到,一个人体内细胞如果出现癌变,细胞中功能正常的p53就会立即停止该癌变细胞的分裂分化,而一旦人体内癌症细胞中的p53出现异常,就会导致该细胞无限制的繁殖,出现整个组织的癌变。在1989年报道中【8】,第一次发现结直肠癌细胞中的p53出现了突变,至今已经有超过800篇文献研究过这个问题,其中就有报道称,在体内,野生型的p53可以抑制结直肠癌肿瘤的发生发展。microrna(mirna)是一种有内源基因编码的、长度大概为22个核苷酸的非编码单链rna分子,在动植物体内广泛存在,主要参与了生物体内基因表达调控作用,目前为止,文献报道过的人类已经发现的rna分子个数为28645个。microrna(mirna)是属于小rna的一种【10】,在组织细胞中起着极其重要的调控作用,每个mirna都有自己特定的靶基因,通常可以一个mirna调控多个基因,也可以几个mirna调控同一个基因,从而在人体内形成了一个复杂的基因调控网络。结直肠癌细胞中存在着mirna异常表达的研究起始于2003年,michael【16】等报道,与正常粘膜组织对比,结直肠癌腺瘤和腺瘤阶段的组织中都存在着mirna-143的表达恒定下调。目前研究已经肯定多种mirna的异常表达与结直肠癌的发生发展过程密切相关,有些mirna分子在发病过程中起着致癌基因的作用,如mirna-21、mirna-17-92等【11、12】在结直肠癌细胞中表达明显增高,并分别通过抑制靶基因pdcd4、spry2和e2f1等的表达促进肿瘤的发展【13、14】,另一些mirna分子则起着抑癌基因的作用并在结直肠癌细胞中的表达下调,如mirna-143、mirna-145和mirna-200等,这些mirna对靶基因的k-ras、erk5和zeb1等表达的抑制减弱在结直肠癌的发生发展【15】中起着重要作用。mirna-300是一个高度保守的mirna,最初被认为是一个特异性的调控造血祖细胞增殖及粒系分化的mirna。目前对mirna-300的表达研究在血液性疾病中较多,例如,在急性粒细胞白血病中,mirna-300的表达明显下调;mirna-300在慢性淋巴细胞性白血病中表达下调;mirna-300调控粒细胞的增殖和分化;在髓外细胞瘤中mirna-300的表达缺失【18、19、20】。此外,研究还发现,mirna-300在肝细胞癌、原发性的小细胞性肺癌中表达下调;而在食管鳞状细胞癌、肝内胆管细胞癌、膀胱癌及胃癌中表达上调。由此可见,mirna-300与肿瘤的发生、发展可能存在一定的联系。由于mirna-300是一类新发现的mirna,所以目前对其研究较少,之前的文献对于mirna-300与肿瘤的关系的报道更多的集中在血液病中,且对于其分子机制并没有进行深入的研究,本研究的主要目的是通过发现mirna-300在结直肠癌细胞中表达水平的变化,并对其进行深入的研究,来探究mirna-300在结直肠癌中的作用机理。主要拟解决的问题是:1,在结直肠癌组织细胞中以及结直肠癌细胞系中,是否存在mirna-300表达水平的改变;2,mirna-300对结直肠癌细胞是否有着明显的作用;3,通过把经过mirna-300转染的结直肠癌细胞植入裸鼠,研究mirna-300对在体肿瘤生长的影响;4,mirna-300导致肿瘤异常增殖和侵袭的分子机制。研究方法1、结直肠癌中的异常表达mirnas筛选及验证,采用组织芯片初步筛选技术在结直肠癌组织中探测表达明显改变的mirna。利用荧光定量验证在结直肠癌组织和结直肠癌细胞系中的mirna表达水平。并通过westernblot及数理统计研究mirna-300在不同结直肠癌细胞系中的表达分布。2、通过病毒转染,研究mirna-300对结直肠癌细胞系增殖和侵袭能力的影响。分别是通过细胞成团实验来研究结直肠癌细胞系增值能力的变化,以及利用细胞侵袭实验来研究mirna-300含量的提高对细胞侵袭能力的影响。3、通过将mirna-300转染的结直肠癌细胞系和未经过mirna-300转染的结直肠癌细胞系分别注入裸鼠皮下,研究mirna-300对结直肠癌细胞系在裸鼠体内成瘤能力的影响。4、通过基因筛选选择mirna-300潜在靶基因,并通过westernblot以及荧光素酶实验验证mirna-300与p53之间的联系。结果:1、通过对结直肠癌组织芯片和结直肠癌细胞系中mirna-300表达水平的测量,发现在原发性结直肠癌、淋巴转移及远处转移的结直肠癌中mirna-300的表达水平明显高于正常组织细胞。相较于正常癌旁组织,原发性结直肠癌组织细胞中mirna-300含量高约27%:而在淋巴转移及远处转移结直肠癌细胞中,相较于正常癌旁组织,mirna-300含量提高约18%及19%。在结直肠癌细胞系中,sw620比正常黏膜组织细胞系中mirna-300含量高约41%,caco2及ht29细胞系相较正常黏膜组织细胞系mirna-300提高约20%及24%。该统计结果具有显著性差异,p0.05。2、经过MiRNA-300转染的结直肠癌细胞与未经过转染的结直肠癌细胞相比,细胞侵袭力和细胞活性明显增强。在细胞活性的检测中,经过MiRNA-300转染后的结直肠癌细胞系比未经过MiRNA-300转染的结直肠癌细胞系细胞活性高23%;在细胞成团实验中,经过转染的结直肠癌系聚集成团现象明显多于未经过转染的结直肠癌细胞系,经过细胞计数,成团细胞高约70%;在48小时细胞侵袭实验中,经过转染的结直肠癌细胞系侵袭距离大概为未经过转染的结直肠癌细胞系侵袭距离的2倍。3、在裸鼠体内经过MiRNA-300转染的结直肠癌细胞比未经过转染的结直肠癌细胞成瘤能力明显增强。分别测量二者的体积和重量后得知,经过MiRNA-300转染的结直肠癌细胞系的平均成瘤体积为1130mm3,平均重量为0.8g;而在未经过转染的结直肠癌细胞系中,平均成瘤体积为840 mm3,平均重量为0.46g;体积增长约为35%,而重量增长约为74%。该统计具有显著性差异,p0.05。4、通过检测发现MiRNA-300与p53有着明显的协同作用,MiRNA-300的上调及下调分别导致了p53含量的升高及降低;之后又发现MiRNA-300与p53的3’-UTR有着明显的荧光共定位现象,由此我们可以推断p53正是3’-UTR的下游调控靶基因。结论:1、在原发性结直肠癌细胞中MiRNA-300含量相较于整肠黏膜组织细胞有所提高,而在淋巴转移和远处转移的结直肠癌组织中MiRNA-300的含量也有所提升。而在分别代表三种不同类型的细胞系中我们验证了相同的结果。2、经MiRNA-300转染后的结直肠癌细胞系细胞活性增强及细胞聚集成团能力显著提升;经过MiRNA-300转染后的结直肠癌细胞系与正常结直肠癌细胞系相比,细胞侵袭距离显著提高。3、经过MiRNA-300转染后的结直肠癌细胞系与未经过MiRNA-300转染的结直肠癌细胞系相比,成瘤体积及成瘤重量都有着显著的提升,这代表MiRNA-300对结直肠癌细胞系的成瘤能力有着明显的促进作用,也就进一步证实了MiRNA-300对结直肠癌增值能力有着明显的促进作用。4、MiRNA-300的上调及下调分别导致了p53含量的升高及降低,表明了MiRNA-300与p53有着明显的联系,而p53含量的提升与降低也影响着MiRNA-300的表达,二者之间的关系极其密切,MiRNA-300与p53的3’-UTR紧密相接,这就证实了二者在结直肠癌细胞中有着明显的结合,p53正是MiRNA-300的下游调控靶基因,二者在结直肠癌细胞的增殖和侵袭过程中共同发挥作用。


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