自噬相关蛋白ATG4B的线粒体定位及其促HCC细胞生长的作用和机制研究

【摘要】：自噬相关蛋白4B(autophagy related 4B,ATG4B)是C54肽酶家族的一个成员,其在调控哺乳类细胞自噬过程中发挥着关键作用。在自噬发生过程中,细胞通过形成自噬小体包裹受损和衰老的细胞器,并进一步与溶酶体融合,在溶酶体酸性水解酶的作用下将内容物降解成氨基酸等小分子物质,从而为细胞内大分子的重新合成提供原料。在哺乳动物细胞中,微管相关蛋白1轻链3(MAP1LC3/LC3)在自噬小体的形成过程中发挥着十分重要的作用。前体LC3可以通过剪切修饰加工等步骤转化为酯化形式的LC3,从而成为自噬小体的关键组分。研究表明ATG4B可通过对微管相关蛋白轻链3(LC3)系统的调控显著影响自噬小体的组装,进而调控细胞自噬水平,并在细胞代谢,感染与炎症,神经系统疾病以及肿瘤等多种生理和病理过程中发挥着重要作用。近年来,有关ATG4B调控肿瘤细胞增殖的研究开始受到关注。研究表明,ATG4B可通过调控自噬促进骨肉瘤细胞的生长,缺乏ATG4B的骨肉瘤Saos-2细胞不能启动自噬反应,该细胞系在小鼠模型中不能成瘤;使用ATG4B抑制剂能有效抑制骨肉瘤细胞的生长和成瘤。此外,还有研究表明ATG4B可以通过自噬非依赖的方式促进结肠癌细胞的恶性生长。我们的前期研究结果提示ATG4B可能在细胞线粒体中存在定位,但是否具有功能意义尚不清楚。线粒体作为细胞内的能量中心,产生了大多数的ATP以满足细胞能量需求,线粒体功能紊乱可以导致细胞病理性的能量代谢障碍。此外,线粒体产生了细胞内绝大多数的活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS),成为了调控细胞生命活动的重要信号传导者。目前,已有大量研究表明线粒体的功能稳态与肿瘤细胞的恶性进展密切相关,但有关ATG4B是否能直接调控线粒体功能继而影响肿瘤细胞的表型还未见报道。因此,结合文献报道和课题组的前期研究线索,本课题拟通过相关实验研究验证ATG4B的线粒体定位,解析其在促HCC细胞生长中的作用和机制,以期拓展ATG4B的功能研究意义,为基于ATG4B的抗HCC治疗提高新的思路和科学依据。目的:本研究以肝癌细胞为模型,探讨ATG4B的线粒体定位及其促HCC生长的作用及分子机制。方法:1.从不同细胞系和手术切除的组织中分离线粒体,通过westernblot实验检测atg4b在细胞线粒体的表达;2.构建带有gfp标记的重组atg4b质粒,转染细胞后,对细胞进行荧光线粒体标记,并在荧光共聚焦显微镜下观察atg4b与线粒体的共定位;3.通过免疫胶体金标记电镜、线粒体亚成分分离及蛋白酶k保护实验等解析atg4b在线粒体的具体定位;4.使用免疫沉淀联合质谱的方法,筛选与atg4b相互作用的蛋白(含高评分的线粒体蛋白);5.应用免疫共沉淀等技术鉴定atg4b与线粒体线粒体atp合酶亚单位的互作蛋白(atp5a1,atp5b和atp5c1,三者均为线粒体atp合酶f1部分的亚单位);6.使用crispr/cas9基因编辑技术建立杂合敲除的hcc细胞系(atg4b+/-),采用基因过表达等方法,检测atg4b对线粒体atp合酶的活性影响;7.应用westernblot,探索过表达atg4b对细胞生长信号通路的作用及其激活的信号通路对细胞生长的影响;8.使用westernblot,免疫共沉淀及荧光成像等技术,探索akt对atg4b线粒体转位的影响;9.运用生物信息学方法及westernblot,免疫共沉淀及基因克隆等技术,解析akt促atg4b线粒体转位的可能机制(akt磷酸化atg4b第34位的丝氨酸);10.使用akt质粒,atg4b野生型质粒及第34位丝氨酸突变的质粒转染细胞,通过westernblot和cck-8实验等方法,验证akt介导的atg4b第34位磷酸化在促细胞增殖中的重要性;11.使用akt质粒,atg4b野生型质粒及第34位丝氨酸突变的质粒转染细胞,通过westernblot证实atg4b第34位丝氨酸磷酸化对hcc细胞自噬的作用;12.建立atg4细胞内活性检测方法,测量atg4b第34位丝氨酸磷酸化对atg4b切割自噬底物的影响。结果:1.atg4b在哺乳动物细胞的线粒体(尤其是线粒体内部)存在明显定位;2.线粒体的atg4b可以与atp合酶亚单位相互作用而抑制atp合酶的活性;3.蛋白激酶akt/pkb可促进atg4b的线粒体转位;4.atg4b是akt的新的靶蛋白;5.akt通过磷酸化atg4b第34位的丝氨酸而促进atg4b向线粒体转位;6.ATG4B第34位丝氨酸的磷酸化对HCC细胞的生长发挥着重要作用,此种作用可不依赖于ATG4B对细胞自噬的调控。结论:HCC细胞中,激活的AKT会介导ATG4B第34位的丝氨酸发生磷酸化,促进ATG4B的线粒体转位,增加其与线粒体F0F1-ATP合酶亚单位的结合,从而抑制该合酶的活性,继而使细胞代谢发生改变,最终促进了HCC细胞的恶性生长。